چکیده :
آترواسکلروزیس
"بیماری اصلی عروق کرونر قلب" بیماری است که بر روی شریان های بزرگ و
متوسط بدن تاثیر می گذارد. انواع متفاوتی از سلول ها، اندام ها و شماری
از فرآیندهای فیزیولوژیکی در این عارضه درگیر هستند. سیستمRAAS یک سیستم
مهم در تنظیم فشارخون، آب و الکترولیت های بدن انسان و سایر موجودات زنده
است. مطالعه وسیعی روی واریانت های ژن های کد کنندۀ این سیستم، که باعث
گسترش فشار خون و بیماری آترواسکلروزیس می گردد، صورت گرفته است. ژنAGT
نخستین ژنی است که با فشارخون بالا ارتباط دارد و واریانت های این ژن
احتمالا با افزایش فشارخون و گسترش آترواسکلروزیس مرتبط هستند.
این
مطالعه بر روی دومین اگزون ژن AGT (آنژیوتانسین) بر روی 70 فرد مبتلا به
آترواسکلروزیس انجام گرفت. پس از استخراج DNA از نمونه ها و PCR ، ژن تکثیر
شده با روش SSCP 5 برای یافتن پلی مورفیسم یا تغییرات جدید در ژن، مورد
بررسی قرار گرفت. هفت مورد از نمونه های دارای شیفت باندی برای تعیین ماهیت
تغییر، تعیین توالی شدند. در این بررسی دو جهش در موقعیت های 4543T>C و
4360C>T مشخص شد، که در جهش اول متیونین موقعیت 268 به تروئونین
(M268T) و در جهش دوم در کدون 207 اسیدآمینه تروئونین به متیونین (T207M)
تبدیل می گردد. این تغییرات احتمالا افزایش غلظت های پلاسمایی AGT و افزایش
فشارخون را به همراه دارند.
کلمات کلیدی:
آترواسکلروزیس، آنژیوتانسینوژن، PCR-SSCP، موتاسیون، آنژیوتانسین 2، فشار خون بالا
عنوان فهرست مطالب صفحه
1 فصل اول: مقدمه 1
1- 1 بیماری های قلبی 2
1-2 تعریف آترواسکلروزیس 2
1-3 عواملی که در ایجاد آترواسکلروزیس حضور دارند 3
1-3-1 سلول های درگیر در آترواسکلروزیس 3
1-3-2 اکسیداسیون و آترواسکلروزیس 6
1-3-3 التهاب و استرس های اکسیداتیو 7
1-3-4 شکل گیری پلاک ها 9
1-3-5 آشفتگی در مکانیسم های حفاظتی 9
1-4 عواملی که خطر بیماری آترواسکلروزیس را افزایش می دهد 10
1-4-1 کاهش غلظت HDL-C 10
1-4-1-1 ژنتیک های HDL – C 11
1-4-1-2 نقش های متفاوت HDL – C 11
1-4-2 افزایش فشارخون 16
1-4-2-1 سیستم های درگیر در فشارخون 16
1-4-3 سیگارکشیدن 17
1-4-4 ژنتیک و آترواسکلروزیس 17
1-4-4-1 ژنتیک های Dyslipidemia 17
1-4-4-2 پلی مورفیسم های ژنتیکی در نیتریک اکسیدسنتاز اندوتلیالی 18
1-4-4- 3 پلی مورفیسم هادر گلوتاتیون پراکسیداز ( GPx ) 18
1-4- 4-4 پلی مورفیسم های افزایش هموسیستئین 19
1-4-4-5 پلی مورفیسم هایی در فیبرینوژن 19
1-4-4-6 واریانت های میتوکندریایی 20
1-4-5 نقش آلودگی 21
1-5 عواملی که در آترواسکلروزیس جلوگیری می کند 21
1-5-1 استروژن ها 21
1-5- 2 آنتی اکسیدان ها و عمکرد آنها 21
1-5-3 پرهیزهای غذایی 22
1-5-4 ورزش 23
1-6 سیستم RAAS و عملکرد آن 23
1-7 طبقه بندی ترکیبات RAAS و ویژگی شان 25
1-7-1 رنین 25
1-7-2 آنژیوتانسینوژن ، آنژیوتانسین 1 و 2 25
1-7-3 آنزیم مبدل آنژیوتانسین 1 (ACE ) و آنزیم مبدل آنژیوتانسین 2 ( ( ACE2. 26
1-7-4 رسپتورهای 1 و 2 27
1-8 التهاب و سیستمRAAS 29
1-9 واریانت ها در ژن AGT 30
1-10 RAAS موضعی 30
1-10-1 RAAS موضعی در قلب 31
1-11 تولید آنژیوتانسین بافتی 31
1-11- 1 تولید آنژیوتانسین در جریان درونی ( بین شکاف ) 31
1-11-2 تولید آنژیوتانسین در غشاء سلولی 32
1-11-3 تولید آنژیوتانسین در داخل سلول 32
1-12 تاثیرات RAAS روی سلول های قلبی 33
1-13 تاثیرات RAAS روی جریان کرونری 34
1-14 تاثیرات RAAS روی جریان منظم شریان 34
1-15 جداسازی و خالص سازی DNA 36
1-16 واکنش زنجیره پلی مراز 38
1-16-1 مراحل اصلی در واکنش زنجیرۀ پلی مراز 39
1-16-2 طراحی پرایمر 40
1-16-3 دمای اتصال پرایمر 41
1-17 الکتروفورز 42
1-18 روش آشکارسازی اسیدنوکلئیک 43
1-19 یافتن جهش ها با روش PCR – SSCP 44
1-20 تعیین توالی بازهای DNA 46
1-21 مروری بر مطالعات گذشته 48
1-22 اهداف تحقیق 52
2 فصل دوم : مواد و روش ها 53
2-1 مشخصات بیماران 54
2-2 بافرها و محلول ها 55
2-2-1 روش تهیه EDTA 55
2-2-2 روش تهیه الکل 75/ 55
2-2-3 روش تهیه پرایمرها 55
2-2-4 روش تهیه اتیدیوم بروماید 55
2-2-5 روش تهیه بافر TBE 10X 56
2-2-6 روش تهیه بافر TBE ./5X 56
2-2-7 روش تهیه لودینگ بافر PCR 56
2-2-8 روش تهیه لودینگ بافر SSCP 57
2-2-9 روش تهیه محلول NAOH 57
2-2-10 روش تهیه آمونیوم پرسولفات 10/. 57
2-3 کیت استخراج DNA 57
2-4 تکنیک PCR 59
2-4-1 شرایط تکثیر قطعه مورد نظر 60
2-4-2 مراحل PCR 61
2-5 الکتروفورز ژل آگاروز 61
2-6 آنالیز ژل SSCP 62
2-7 آماده سازی ژل پلی آکریل آمید 62
2-8 مراحل رنگ آمیزی ژل SSCP 63
3 فصل سوم : نتایج 64
4 فصل چهارم : بحث و نتیجه گیری 72
4-1 نتیجه گیری 76
4- 3 پیشنهادات 77
4-4 مراجع 78
عنوان فهرست شکل ها صفحه
شکل 1-1: مکانیسم پیشنهادی در وقوع آترواسکلروزیس 10
شکل 1-2 : خلاصه ای از تاثیرات HDL-C 15
شکل 1-3 : کل عملکرد سیستم RAAS 24
شکل 1-4 : مسیر کلاسیک و غیر کلاسیک RAAS 28
شکل 1-5 : ساختار پروتیین های درگیر در سیستم RAAS 29
شکل 1-6 : طرح پیشنهادی تولید آنژیوتانسین 1 و 2 درقلب 33
شکل 1-7 : تاثیرات آنژیوتانسین 2 روی قلب 35
شکل 1-8 : مراحل زنجیره پلی مراز 40
شکل 1-9 : ژل الکتروفورز 43
شکل 1-10 : روش SSCP 46
شکل 3-1 : تصویری از الکتروفورز محصول PCR نمونه های مورد مطالعه بر روی ژل آگاروز 65
شکل 3-2 : تصویری از آنالیز SSCP روی ژل پلی آکریل آمید 66
شکل 3-3 : تشخیص جهش 4360C>T با استفاده از تکنیک SSCP و تعیین توالی 67
شکل 3-4 : تشخیص جهش 4543T>C با استفاده از تکنیک SSCP و تعیین توالی 67
شکل 3-5 : هم ردیفی نوکلئوتید برای تغییر 4360C>T 68
شکل 3-6 : هم ردیفی نوکلئوتید برای تغییر4543T>C 65
شکل 3-7 : هم ردیفی پروتیین برای تغییر T207M 66
شکل 3-8 : هم ردیفی پروتیین برای تغییر M268T 66
شکل 3-9 : نتیجه Blastn برای جهش 4360C> T همولوگ با حیوان pan paniscus 67
شکل 3-10 : نتیجه Blastn برای جهش 4543T> C همولوگ با حیوان pan paniscus..... 67
عنوان فهرست جداول صفحه
جدول 1-1 : فعالیت های رسپتور نوع یک و دو آنژیوتانسین 2 28
جدول 1-2 : مواد لازم جهت تهیه ژل SSCP با درصدهای مختلف 45
جدول 2-1 : مشخصات بیماران 55
جدول 2-2 : مشخصات پرایمر در این مطالعه 59
جدول 2-3 : مقدار مواد مورد استفاده در مخلوط PCR در حجم Lµ25 60
فصل اول:
مقدمه
1
1 بیماریهای قلبی:
بر
طبق آمار منتشر شده بیماری های قلبی در سال 2012، هر ساله در آمریکا حدود
795000 نفر با حمله قلبی مجدد (عود کننده) مشاهده می شوند، و در هر 40
ثانیه یک نفر از هر 18 نفر در نتیجه حمله قلبی دچار مرگ می شود. سالانه
میلیون ها دلار صرف هزینه های درمان بیماری های قلبی می گردد. اگرچه میزان
مرگ و میر در بیماران قلبی کاهش یافته است، اما ظرفیت باقی مانده هنوز هم
بالا است (1).
2 تعریف آترواسکلروزیس:
تصلب شرایین یا سختی رگ ها
(آترواسکلروزیس)، یک بیماری عروقی است و نوعی از آرتریواسکلروزیس
(Arteriosclerosis) است که با رسوب لیپید و مواد دیگر بر روی دیواره داخلی
برخی رگ ها مشخص می گردد. نتیجه این فرآیند تشکیل پلاک های فیبری- چربی
(آتروما) بوده که با افزایش سن رفته رفته زیاد می شود و موجب تنگی رگ و یا
دیگر عواقب می گردد (2).
تصلب شرایین یکی از دلایل عمده مرگ و میر
بزرگسالان در جوامع پیشرفته است، به طوری که در ایالات متحده آمریکا به
تنهایی سالانه حدود 112 میلیارد دلار هزینه در بر دارد (3) .
آرتریواسکلروز
یک اصطلاح کلی برای ضخیم‌شدن و سفتی دیواره شریانی است (تصلب شرایین). یک
نوع آرتریواسکلروز، آترواسکلروز است این بیماری در شریانهای بزرگتر ایجاد
می‌شود. در این بیماری عروق و رگ‌ها حالت ارتجاعی خود را از دست می‌دهند و
قطر عروق تغییر می‌کند. بالا بودن کلسترول خون، فشار خون بالا، عوامل
ژنتیک و مصرف سیگار احتمالاً مهم‌ترین عوامل دخیل در ایجاد آترواسکلروز
هستند. آترواسکلروز با ایجاد سکته قلبی و مغزی مهم‌ترین عامل مرگ و میر در
جوامع غربی است (3).
آرﺗﺮیواﺳکلروز در ﻣﺮدان ﺷایع ﺗﺮ اﺳﺖ. افزایش میزان پراکسیداسیون لیپیدی از علل اصلی شروع و پیشرفت آرتریواسکلروز محسوب می‌گردد (3).
1- 3 عواملی که در ایجادآترواسکلروزیس نقش دارند:
1-3-1 سلول های درگیر در آترواسکلروزیس:
آترواسکلروزیس یک بیماری چند مرحله ای است که با تجمع اندوتلیال محتوی ApoBشروع می شود (4و6).
تغییراتی
مثل اکسیداسیون و هیدرولاسیون، فعالیت سلول های اندوتلیال را پیش می برد.
این سلول ها مواد جاذب ترشح کرده که کموکاین3 نامیده می شود که با رسپتور
های سطح منوسیت4 واکنش می دهند (4و6) .منوسیت ها به تنهایی با اینتگرین5 ها
در سلول های اندوتلیال برهم کنش می دهند. بعد از اتصال، یک مرحلهی توقف
اتفاق می افتد و سپس منوسیت ها به فضای زیراندوتلیال وارد می گردند (4و6).
ورود
منوسیت ها به داخل اندوتلیال با ماکروفاژها متفاوت است. این مرحله با
واکنش های ماتریکس داخل سلولی و سایتوکاین هایی مثل فاکتور محرک کلونی
ماکروفاژیو یکسری فاکتورهای نکروزی توموری2 صورت می گیرد (4و6).
LDL3
اکسیده، توسط رسپتورهای لاشخوری نوع A (SRA) 4 و CD36 در ماکروفاژها برداشت
می گردد. استرهای کلسترول در ذرات apoB به کلسترول آزاد 5 هیدرولیز می
گردد. کلسترول آزاد به داخل شبکه ی آندوپلاسمی رها شده و دوباره با استیل
COA استری می گردد و به صورت استرهای کلسترول انتقال می یابد. انتقال هم
توسط ACAT16در ماکروفاژها صورت میگیرد. ACAT1 در شکل گیری سلول های کف
آلود7 در دیوارهی شریان و گسترش آترواسکلروزیس شرکت دارد. تشکیل هستههای
نکروزی و پوشش لیفی مانند8، توسط ماکروفاژها باعث آسیب شریان است (4و6).
متالوپروتئینازهای
ماتریکسی مشتق شده از ماکروفاژها (MMps)10 یک خانواده از پروتئین ها هستند
که تخریب ماتریکس داخل سلولی (ECM)11، را بر عهده دارند. که نتیجهی تخریب،
جدایی پلاک ها است. البته ماکروفاژها، باعث نازک شدن و افزایش آسیب پذیزی
پلاک را از طریق آپوپتوز سلول های ماهیچه ای صاف، که کاهش شمار سلول های
ماهیچه ای صاف است را نشان می دهند (4و7).
ماکروفاژها هم چنین آپوپتوز
را در سلول های ماهیچه ای صاف با ترشح TNF-α و اکسید نیتریک تشدید می کنند.
ماکروفاژها با ترشح TNF-β ممکن است مانع سلول های همسایه SMCs 3 در القاء
سنتز کلاژن شوند. حتی بعد از جدایی پلاک، ماکروفاژها یک نقشی در ترشح
فاکتور پروتوترومبیک بافتی4 که شکل گیری پلاک را سریع تر می کند بازی می
کنند. هسته های نکروزی تولید شده در ترکیب آپوپتوزی، در افزایش تجمع
ماکروفاژها نقش دارد. هسته های نکروزی هم چنین در التهاب و ایجاد لخته،
جدایی پلاک ها و استرس های فیزیکی روی پوشش لیفی شکل شرکت دارد (4و6).
اکنون
پذیرفته شده است که آترواسکلروزیس یک بیماری مزمن دیواره شریان است که هر
دو سیستم ایمنی در آن درگیر است. سلول های دندریتیک5 یک جمعیت متفاوت از
سلول ها هستند که از مغز استخوان مشتق شده اند و به طور اختصاصی در به دام
انداختن و ارائه آنتی ژن به لنفوسیت های T6 نقش دارند. این سلول ها در از
بین بردن آنتی ژن های داخل سلولی که با فاگوسیتوز7 و اندوسیتوز8 با واسطه
رسپتور وارد می شوند، کارآمد هستند. سپس این سلول ها قطعه ای از آنتی ژن را
نشان می دهند که به MHCII9 باند می شود و به وسیله ی سلول های T با CD4+
شناسایی می گردد. سلول های دندریتیک یکسری پیام های کمک تحریکی مثلB7-1
یاB7-2 که سلول های T با +CD4 را تحریک می کند، تولید می کنند. سلول های T و
DCs به طور خوشه ای آرایش می یابند که اصولا در مناطق مستعد پلاک قرار
دارند (4و5).
1-3-2 اکسیداسیون و آترواسکلروزیس
نتیجه اختلال در عملکرد اندوتلیال، ضخامت دیواره ی رگ، در نتیجه رسوب مواد چربی و پلاک ها است (23).
ارتباطی
بین فاکتورهای خطر آترواسکلروزیس (ARFs)و افزایش تولید شریانی ROS2 وجود
دارد. بیشترین اهمیت این فاکتورها این است که موروثی هستند (23).
ROS
وRNS 3 باعث آزادسازی سیتوکروم C میتوکندریایی می شود. و مسیرهای مرگ طبیعی
را پیش می برند. تولید موضعی RNS ممکن است با آسیب بافت شریانی همراه باشد
(23). سطوح بالای ROS در مسیر آپوپتوز طبیعی و آسیب بافتی در وضعیت های
پاتوفیزیولوژیکی به عنوان یک قسمت تثبیت کننده پلاک های آترواسکلروزیس به
شمار می رود (23).
یک مکانیسم درگیر، در ox- LDL4 و NOS5 در رویداد آترواسکلروزیس پیشنهاد شده است:
ox-LDL،
آزادسازی اینترلوکین 1 از سلول های اندوتلیال و ماکروفاژها را تحریک می
کند به علاوه NO، اتساع عروق6 و اثرات سایتوکاین ها و ملکول های چسبندهی
مرتبط با آترواسکلروزیس را مهار می کند.
ox- LDL اختلال در عملکرد
اندوتلیال را ایجاد می کند. رادیکال های اکسیژن ممکن است به طور غیر مستقیم
دلیل اختلال در عملکرد اندوتلیال با کاهش NO می باشد (8و23).
به طور
ویژه، سوپراکسیدها ی تولید شده سریع با NO واکنش داده که نتیجهی آن تشکیل
پراکسی نیتریت و از دست رفتن فعالیت زیستی NO است (8و23).
ROS و پراکسی
نیتریت می توانند تتراهیدروبیوپترین که کوفاکتور2 حساس برای NO سنتاز
اندوتلیالی است را اکسید کنند و فعالیت آن را مهار کنند (8و23).
در
رویداد آترواسکلروزیس و ایسکمی قلبی، NO نقش مهمی در جلوگیری از عملکرد
نامناسب اندوتلیال بازی می کند و در مقابل رادیکال های اکسیژن محافظت می
کند. NOهم چنین از آپوپتوز و اختلال در عملکرد میتوکندریایی جلوگیری می کند
(8و23).
1-3-3 التهاب و استرس های اکسیداتیو:
مطالعات روی سیستم
ایمنی و افزایش فشار خون نشان دهندهی یک ارتباط نزدیک بین نفوذ سلول های
التهابی و استرس های اکسیداتیو در بافت های قلبی است. در حقیقت یکی از
مکانیسم های اصلی در سیستم RAAS که علت بیماری قلبی است، افزایش فشار خون
با تولید گونه های اکسیژن فعال است (20و31).
رادیکال های آزاد می توانند
با همه ی ملکول های زیستی برهم کنش داشته باشند. شامل لیپیدها، پروتئین
ها، نوکلئیک اسید ها، کربوهیدرات ها و اکسید نیتریک (NO) که در رشد وتقسیم
سلولی، که ماتریکس سلولی را افزایش می دهد نقش دارد نتایج تولید ROS روی
شریان قلبی، آسیب سلولی و اختلال در عملکرد اندوتلیال است (20و31).
اخیر مکانیسم هایی که چگونه، RAAS به افزایش ROS کمک می کند مشخص شده است:
Ang22
و آلدوسترون هر دو بیان NADPH اکسیداز را القاء می کنند که آنزیم اصلی در
تولید سوپراکسید بافت شریانی است. رادیکال های آزاد در حقیقت به عنوان فعال
کننده های التهاب عمل می کنند. استرس های اکسیداتیو نفوذپذیری شریان را
تحریک می کنند. و باعث افزایش ترشح واسطه های التهابی مثل پروستاگلاندین ها
و فاکتورهای رشد اندوتلیالی شریانی (VCAM-1) 3 می گردند (31).
Ang2
بیان ملکول های چسبندگی (VCAM- 1) و ملکول چسبندگی داخل سلولی 1 (ICAM- 1) 4
و E- سلکتین5 که در مسیر تولیدات ROS درگیر است را افزایش می دهد. هجوم
سلول های التهابی باعث بزرگ شدن دیواره رگ می گردد. که غنی ازNADPH اکسیداز
و افزایش استرس های اکسیداتیو موضعی است. در مرحله ی پایانی، مکانیسم های
ترمیم بافت به وسیله ی استرس های اکسیداتیو ظاهر می گردد (31).
Ang2 و
آلدوسترون باعث افزایش فشار خون و هیپرتروفی و آپوپتوز و فیبروس2 شریانی می
شوند. که نتیجهی آن تقسیم سلولی و خروج ماتریکس و کلاژن های اصلی و
فیبرونکتین است که با تغییر شریان و افزایش سفتی شریان همراه است (31).
1-3- 4 شکل گیری پلاک ها:
شکل
گیری پلاک در منطقه ای دور از استرس های شریان، که تقریبا در شاخه های
شریان است اتفاق می افتد. این فرضیه مرتبط با الاستین در این جایگاه و حضور
کمپلکسهای کلاژن - پروتوگلیکان است که مسبب حبس LDL است. جدایی پلاک به
طور معمول علت سندرم شریان کرونری است (25).
1-3-5 آشفتگی در مکانیسم های حفاظتی:
آشفتگی در شناسایی مکانیسم های حفاظتی ذاتی در اندوتلیوم، دلیل تشکیل ترومبین3(ماده انعقاد) است (25).
انسداد
شریان کرونر، تشکیل لخته خون، جدایی پلاک ها، در ناحیه ای از
آترواسکلروزیس، مربوط به 60 تا 80 درصد از موارد سندرم کرونر حاد (ACS)4
است (25). التهاب ، واسطه ی رگ دار شدن5 و انتقال خون به داخل پلاک ها، به
تنهایی با بافت مردگی6 در مرکز پلاک همراه است که اغلب ایجاد لخته می کند.
مکانیسم کلی ایجاد آترواسکلروزیس در شکل1-1 آمده است (25).
شکل 1-1 : مکانیسم پیشنهادی در وقوع آترواسکلروزیس (25).
1- 4 عواملی که خطر بیماری آترواسکلروزیس را افزایش می دهد:
1-4-1 کاهش غلظت HDL- C:
کلسترول
خالص (HDL- C) بیشترین نشانه برای آترواسکلروزیس است. مطالعات اپیدمیولوژی
نشان داده که سطوح HDL- C پایین ، خطر بیماری CVD را افزایش می دهد. زمانی
که (HDL- C) به عنوان یک فاکتور خطر تایید می گردد. خطر باقی مانده مرتبط
با عملکرد های لیپوپروتئین های دیگر است (24).
1-4 -1 -1 ژنتیک های HDL:
همه ی شکل های ژنتیکی با HDL- C پایین و apoA- I مرتبط با افزایش خطر بیماری CVD نیست.
اخیرا
جهشهایی در ژن ABCA1 در بیماری Tangier با افزایش خطر بیماری قلبی مرتبط
نیست. موتاسیون های دیگری در apoA- I که علت پایین HDL- C و apoA- I است
مرتبط با CVD زودرس نیست. اخیرا ژن های مرتبط با افزایش درغلظت HDL- C
(اندوتلیال لیپاز وCETP) ارتباطی با کاهش خطر بیماری قلبی ندارد (24).
1-4-1-2 نقش های متفاوتC-HDL:
1 . آنتی اکسیدان2
HDL- C از فرم های آسیب رسان LDL OX-در چندین مکانیسم جلوگیری می کند (24).
آنزیم
های مختلفی وجود دارد که گلوتاتیون سلنوپراکسیداز و Paraoxonaas1 (PON1)
که اکسیداسیون لیپیدها یا تخریب لیپیدهای هیدرو پراکسید را ایجاد می کنند و
روی HDL- C حضور دارند را کاهش می دهد (24).
2 . فعالیت ضد التهابی
آترواسکلروزیس
یک بیماری التهابی است. HDL- C از التهاب رگ ها در مسیرهای متفاوت جلوگیری
کرده است. HDL-C بیان فاکتور نسخه برداری هسته ای NF- Kb که ملکول های
چسبندگی سلولی را فعال و با کمپلکس AI/ABCA1 ماکروفاژی برهم کنش می دهد را
تغییر می دهد (24).