بررسی نسبت جمعیتی اسپرم‌های واجد کروموزم X‌و Y تحت تأثیر برخی عوامل محیطی در گونه گاو با استفاده از تکنیک Real-Time PCR

بررسی نسبت جمعیتی اسپرم‌های واجد کروموزم X‌و Y تحت تأثیر برخی عوامل محیطی در گونه گاو با استفاده از تکنیک Real-Time PCR فهرست مطالب عنوان صفحه چکیده فارسی 1 مقدمه 2 فصل اول: کلیات پیشگفتار 4 آناتومی دستگاه تناسلی دام نر 5 اسپرماتیک کورد (بند بیضه) 6 1-1-2- اسکروتوم(کیسه بیضه) 6 ماهیچه دارتوس 7 تونیکا واژنیالیس 7 بیضه‌ها 8 اپیدیدیم 10 غدد ضمیمه تناسلی 12 آمپولا 12 1-1-5-2- وزیکول سمینال 12 1-1-5-3- پروستات 13 1-1-5-4- غدد کوپر 13 آلت تناسلی نر 14 فیزیولوژی دستگاه تناسلی دام نر 15 1-2-1- اسپرماتوژنز 15 1-2-1-1- اسپرماتوسیتوژنز 15 1-2-1-2- اسپرمیوژنز 15 1-2-1-3- روند کلی اسپرماتوژنز 16 1-2-2- اسپرم 20 1-2-3- مایع منی 21 نسبت جنسی 21 1-3-1- مقدمه 21 ژنتیک دام نر 22 تفاوت اسپرم‌های واجد کروموزوم X و Y 23 تعریف نسبت جنسی 25 اهمیت کنترل نسبت جنسی 26 عوامل موثر بر انحراف نسبت جنسی 27 1-3-6-1- عوامل ژنتیکی و فیزیولوژیکی 27 1-3-6-2- عوامل محیطی 28 روش‌های تعیین نسبت جنسی اسپرم 28 واکنش زنجیرهای پلیمراز کیفی( PCR) 29 واکنش زنجیرهای پلیمرازکمّی((Real-Time PCR 31 1-5-1- تعریف واکنش (Real-Time PCR) 31 1-5-2- مزایای واکنش Real-Time PCR 31 مراحل اصلی واکنش Real-Time PCR 32 1-5-4- روشهای انجام واکنش Real-Time PCR 32 1-5-4-1- قالب غیر اختصاصی Nonspecific Format 32 1-5-4-2- قالب اختصاصی Specific Format 34 1-5-4-2-1- شناساگرهای دوسویه نشاندار یا شناساگرهای TaqMan 35 1-5-4-2-2- شناساگرهای بیکون مولکولی 37 1-5-4-2-3- سیستم شناساگر FRET 38 1-5-4-2-4- شناساگرهای عقربی 39 1-5-4-2-5- سایر سیستمها 40 1-5-5- برخی مفاهیم و اصطلاحات در تکنیک Real-Time PCR 41 1-5-5-1- منحنی تکثیر 41 1-5-5-2- گزارشگر نرمالشده((Rn 43 1-5-5-3- چرخه آستانه( (CT 44 1-5-5-4- منحنی ذوب 45 1-5-5-5- منحنی استاندارد 47 1-5-6- آنالیز داده‌های کمی 49 فصل دوم: مروری بر متون گذشته مطالعات پیرامون نسبت جنسی 51 مطالعات روی روشهای تعیین نسبت جنسی 53 فصل سوم: مواد و روشها زمان و محل انجام تحقیق 58 مراحل انجام کار 58 3-2-1- تهیه اسپرم 58 3-2-2- استخراج DNA از سلولهای اسپرم 59 3-2-2-1- مواد و لوازم استخراج DNA 59 3-2-2-2- روش کار برای استخراج DNA 60 3-2-2-2-1- شستشوی اسپرم 60 3-2-2-2-1-1- ساخت محلول PBS 60 3-2-2-2-1-2- شستشو 61 3-2-2-2-2- پروتئینزدایی 62 3-2-2-2-2-1- ساخت محلول Lysis Buffer 62 3-2-2-2-2-2- رسوب پروتئینها 62 3-2-2-2-3- جداسازی DNA 63 3-2-2-2-4- تعیین غلظت DNA 64 3-2-2-2-4-1- استفاده از ژل آگارز 64 3-2-2-2-4-1-1- مواد و لوازم ساخت ژل آگارز 64 3-2-2-2-4-1-2- روش کار با ژل آگارز 65 3-2-2-2-4-2-- استفاده از دستگاه اسپکتروفوتومترِ نانودراپ 66 3-2-3- واکنش PCR کیفی 66 3-2-3-1- هدف از واکنش PCR کیفی 66 3-2-3-2- مواد و لوازم برای واکنش PCR کیفی 66 3-2-3-3- روش انجام واکنش PCR کیفی 67 3-2-3-3-1- طراحی آغازگر 67 3-2-3-3-2- رقیقسازی آغازگرها 68 3-2-3-3-3- محاسبه مقادیر واکنشPCR کیفی 69 3-2-3-3-4- تعیین شرایط واکنشPCR کیفی 70 3-2-3-3-5- آمادهسازی مخلوط واکنشPCR کیفی 70 3-2-3-3-6- الکتروفورز محصولات PCR کیفی 71 3-2-4- واکنش Real-Time PCR 71 3-2-4-1- - هدف از انجام واکنش Real-Time PCR 71 3-2-4-2- مواد و لوازم برای واکنش Real-Time PCR 71 3-2-4-3- روش انجام واکنش Real-Time PCR 72 3-2-4-3-1- رقیقسازی آغازگرها 72 3-2-4-3-2- محاسبه مقادیر در واکنش Real-Time PCR 73 3-2-4-3-3- تعیین شرایط دمایی و زمانی واکنش Real-Time PCR 73 3-2-4-3-4- رسم منحنی استاندارد از طریق واکنش Real-Time PCR 74 3-2-4-3-5- بررسی CT و TM از طریق واکنش Real-Time PCR 74 3-2-4-3-6- آمادهسازی مخلوط واکنش Real-Time PCR 76 3-2-4-3-7- آنالیز دادههای واکنش Real-Time PCR 76 فصل چهارم : نتایج 4-1- نتایج استخراج DNA 78 4-1-1- نتیجه الکتروفورز محصولات استخراجDNA. 78 4-1-2- نتیجه غلظتخوانی با دستگاه نانودراپ 79 4-2- نتیجه الکتروفورز محصولات PCR. 80 4-3- نتایج حاصل از Real-Time PCR.. 82 4-3-1- منحنی استاندارد................................................................................................. 82 4-3-2- منحنی ذوب و محاسبه TM.............................................................................. 83 4-3-3- منحنی تکثیر و محاسبه CT............................................................................ .87 4-3-4- نتیجه الکتروفورز محصولات Real-Time PCR............................................... .90 4-3-5- آنالیز کمّی دادهها............................................................................................... 94 فصل پنجم : بحث وپیشنهادات 5-1- بحث ............................................................................................................. .99 5-2- پیشنهادات................................................................................................. 102 منابع 103 چکیده انگلیسی 106 ضمایم 108 فهرست جداول عنوان صفحه جدول(3-1):شماره ثبت شده دام روی پایوتهای محتوی مایع منی………………………….………. 58 جدول(3-2): مواد تشکیل دهنده محلول PBS ………………………………………………………… 60 جدول(3-3): مواد تشکیل دهنده محلول Lysis Buffer ………….……………...………………… 62 جدول(3-4): اطلاعات مربوط به آغازگرها ……………………………………………………………….. 68 جدول(3-5): مقادیر مواد واکنش PCR ………………………………………………………………… 69 جدول(3-6): شرایط دمایی و زمانی واکنش PCR ……………………………………………………. 70 جدول(3-7): مقادیر مواد واکنش PCR ………………………………………………………………… 73 جدول(3-8): شرایط دمایی و زمانی واکنش PCR Real-Time ……….…………………….…… 74 جدول (4-1):غلظت DNA ( ng.µl-1 ) برای 7 رأس گاو در فصل سرد…….…………………….… 79 جدول (4-2): غلظت DNA ( ng.µl-1 ) برای 7 رأس گاو در فصل گرم…….…………....………… 79 جدول (4-3) : محاسبه میانگین عدد CT بین دو تکرار در هر نمونه……….……….......………..… 95 جدول (4-6) : عدد مقیاس مطلق(تفاوت عدد الگوی اولیه ژن SRY و PLP ….………............ ………………97 فهرست اشکال عنوان صفحه شکل (1-1) : اسپرماتیک کورد(بند بیضه) …………………………………………………………… 6 شکل (1-2) : اسکروتوم (کیسه بیضه) ………………………………………………………………… 7 شکل (1-3) : بیضه ها در گاو …………………………………………………………………………. 8 شکل (1-4) : بیضه ها ولوله های اسپرم ساز و شبکه رته تستیس ………………………………… 10 شکل (1-5) : اپیدیدیم ………………………………………………………………………………… 11 شکل (1-6) : غدد ضمیمه تناسلی …………………………………………………………………… 13 شکل (1-7) : آلت تناسلی گاو نر …………………………………….……………………………… 14 شکل (1-8) : اسپرماتوژنز ……………………………………………………………………………… 16 شکل (1-9) : اسپرماتوژنز و هورمونها ………………………………………………………………. 17 شکل (1-10) : مراحل سلولی اسپرماتوژنز …………………………………………………………… 19 شکل (1-11) : اسپرم …………………………………………………………………………………. 20 شکل (1-12) : کاریوتیپ گاو ………………………………………………………………………… 22 شکل (1-13) : اسپرم واجد کروموزوم Y و X ……………………………………………………… 24 شکل( 1-14) : مکانیسم عمل رنگ SYBR-Green طی واکنش زنجیره‌ای پلیمراز(PCR)……33 شکل( 1-15) : مکانیسم عمل شناساگرهای دوسویه نشاندار یا شناساگرهای TaqMan ………………..36 شکل( 1-16) : مکانیسم عمل شناساگرهای بیکون مولکولی طی واکنش زنجیره‌ای پلیمراز(PCR)…….… 37 شکل( 1-17) : مکانیسم عمل شناساگر FRET طی واکنش زنجیره‌ای پلیمراز(PCR) ……… 38 شکل( 1-18) : مکانیسم عمل شناساگر عقربی طی واکنش زنجیره‌ای پلیمراز(PCR)…..……… 40 شکل (1-19) : منحنی تکثیر در واکنش Real-Time PCR ………………………………..... 42 شکل (1-20) : رنگ مرجع خنثی) (ROX ……………………………………………………… 43 شکل (1-21) : منحنی تکثیر و نمایش CT ………………………………………………………. 44 شکل (1-22) : منحنی ذوب و Tm ………………………………………………………………… 46 شکل (1-23) : منحنی استاندارد ……………………………………………………………………. 48 شکل(3-1):پایوتهای محتوی مایع منی …………………………………………………………… 58 شکل (4-1) : نتایج حاصل از استخراج DNA …………………………………………………... 78 شکل( 4-2 ): نتایج حاصل از PCR ……………………………………………………………….. 81 شکل (4-3) : منحنی استاندارد …………………………………………………………………….. 82 شکل( 4-6 ): منحنی ذوب و میزان Tm محاسبهشده برای آغازگر SRY در فصل گرم …….. 84 شکل( 4-7 ): منحنی ذوب و میزان Tm محاسبهشده برای آغازگر SRY در فصل سرد ……. 84 شکل( 4-8 ): منحنی ذوب و میزان Tm محاسبهشده برای آغازگر PLP در فصل گرم ……. 85 شکل( 4-9 ): منحنی ذوب و میزان Tm محاسبهشده برای آغازگر PLP در فصل سرد ……. 85 شکل( 4-10 ): منحنی ذوب و میزان Tm محاسبهشده برای آغازگر PARدر فصل گرم……. 86 شکل( 4-11 ): منحنی ذوب و میزان Tm محاسبهشده برای آغازگر PARدر فصل سرد……. 86 شکل( 4-12 ): منحنی تکثیر و میزان CT مربوطه برای آغازگر SRY در فصل گرم ………….87 شکل( 4-13 ): منحنی تکثیر و میزان CT مربوطه برای آغازگر SRY در فصل سرد………… 87 شکل( 4-14 ): منحنی تکثیر و میزان CT مربوطه برای آغازگر PLP در فصل گرم ………… 88 شکل( 4-15 ): منحنی تکثیر و میزان CT مربوطه برای آغازگر PLP در فصل سرد ………… 88 شکل( 4-16 ): منحنی تکثیر و میزان CT مربوطه برای آغازگر PAR در فصل گرم………… 89 شکل( 4-17 ): منحنی تکثیر و میزان CT مربوطه برای آغازگر PAR در فصل سرد .……… 89 شکل( 4-18 ) : نتیجه واکنش qPCR برای آغازگر SRY ……………………………….... 91 شکل (4 - 19): نتیجه واکنش qPCR برای آغازگر SRY ………………….………..……… 91 شکل(4-20) : نتیجه واکنش qPCR برای آغازگر PLP ………..…………………..………… 92 شکل(4-21) : نتیجه واکنش qPCR برای آغازگر PLP …………………………..…………92 شکل(4-22) : نتیجه واکنش qPCR برای آغازگر ..………………………..…………PAR 93 شکل(4-23) : : نتیجه واکنش qPCR برای آغازگر .……………………..…………PAR...... 93 شکل (4-24) : فرمولهای محاسبه و آنالیز کمّی آزمایش …………………………………..… 96 چکیده فارسی: جنسیت موالید در صنعت دامپروری و از نظر اقتصادی بسیار حائز اهمیت است.افزایش بهرهوری اقتصادی و نیز کنترل بیماریهای ژنتیکی وابسته به جنس ارتباط مستقیمی با جنسیت موالید دارد.نسبت جنسی موالید اتفاقی نبوده و عوامل مختلفی در تعیین جنسیت موالید نقش دارد.یکی از این عوامل،نسبت جنسیتی اسپرمهای واجد کروموزوم X و Y در انزالِ طبیعی است. مهم‌ترین عوامل محیطی که احتمال می‌رود روی این نسبت تاثیر داشته باشد،استرس گرماییو تفاوت‌های فردی می‌باشد. در مطالعه حاضر به بررسی تغییر نسبت جمعیتی اسپرم‌های واجد کروموزوم Y به اسپرم‌های واجد کروموزومX در انزال گاو نر تحت تاثیر تنش گرمایی و بررسی تفاوت‌های فردی با استفاده از تکنیک Real-Time PCR پرداخته شد. به این منظور از 7 رأس گاو نر بالغ در دو فصل گرم (تحت تأثیر استرس گرمایی) و سرد نمونهگیری به عمل آمد و پس از استخراج محتوی ژنتیکی، با استفاده از سه جفت آغازگر ژنهای SRY (شاخص کروموزوم Y)،PLP (شاخص کروموزوم X ) و PAR (ژن خانهدار)و با استفاده از روش Q-PCR مورد ارزیابی کمی قرار گرفتند.نتایج این تحقیق نشان داد که نسبت جمعیتی کروموزومهای واجد X و Y در انزال طبیعی در میان دامها یکسان نیست.همچنین نشان داد که تنش گرمایی با افزایش نسبت جمعیتی کروموزومهای Y رابطه دارد.کلمات کلیدی: نسبت جنسی، اسپرم، استرس گرمایی، تفاوت فردی، Real-Time PCR مقدمه امروزه در جهت توسعه صنعت دامپروری در راستایبهبود اقتصادی، بهبود ژنتیکی و سلامت دام،یکی از بهترین راهها کنترل جنس موالید و نسبت جنسی است. یکی از بهترین راه‌ها برای بررسی نسبت جنسی موالید و کنترل آن تعیین جنسیت اسپرم‌ها و نسبت آنها است. این نسبت تحت تأثیر عوامل مختلفی از جمله عوامل محیطی و ژنتیکی است. مهم‌ترین عواملی که ممکن است بر این نسبت تأثیر معنی‌داری داشته باشد، استرس گرمایی و تفاوت‌های فردی می‌باشد. به این منظور مطالعه حاضر به بررسی نسبت جمعیتی اسپرم‌های واجد کروموزوم Y به اسپرم‌های واجد کروموزوم X در انزال گاو در دامهای مختلف و تحت تاثیر تنش گرمایی با استفاده از تکنیک Real-Time PCR می‌پردازد. در این آزمایش از روش Real-Time PCR با ماده شناساگر SYBR Green و ارزیابی نسبی استفاده شد. به همین جهت 3 آغازگر (Primer) تحت عنوان SRY (شاخصه کروموزوم(YPlP(شاخصه کروموزوم X) و PAR (به عنوان ژن خانه‌دار) که کنترل داخلی محسوب می‌شود،طراحی شد. فصل اول کلیات پیشگفتار: نسبت جنسی موالید یک شاخص سرشماری مهم است که از اواخر قرن هفدهم مورد بررسی قرار گرفته است. اگر بتوانیم این نسبت را کنترل کنیم یا نتایج نسبت جنسی را تغییر دهیم برای اصلاح نژاد دام در صنعت دامپروری و از نظر اقتصادی بسیار مفید خواهد بود. تئوری نسبت جنسی و توضیح علل و مکانیسم‌های آن هنوز موضوعی قابل بحث است[28 ، 27]. در صنعتپرورش گاو گوشتی تولید گوشت بدون چربی بر پایه تولید گوساله نر می‌باشد.اما در صنعت گاو شیری تولید گوساله ماده به منظور حفظ گله حائز اهمیت است. بنابراین کنترل نسبت جنسی در حیوانات جایگاه بالایی در برقراری تعادل نسبت به نرها و ماده‌ها در گونه‌های در حال انقراض،تسریع روند اصلاح ژنتیکی دام‌ها،تسهیل مدیریت دامپروری و بهره‌های فراوان در دامپروری دارد[27, 3]. در پستانداران در جنس ماده دو کروموزومجنسی مشابه (XX) حضور دارد امادر موجود نر به جهت دارا بودن دو کروموزوم جنسی متفاوت (XY) معین‌کننده جنس فرزند است[11, 10]. پس اگر بتوانیم عوامل موثر بر تغیر نسبت جنسیت اسپرم‌ها (حاوی X و یا Y بودن) را بررسی کنیم و این عوامل را کنترل کنیم،در واقع میتوانیم نسبت جنسی را تحت کنترل بگیریم. دیده شده است که عوامل گوناگونی از جمله محیط و وراثت می‌توانند روی جنسیت اسپرم‌ها موثر باشند. یعنی اینکه منجر به این امر می‌شود که نسبت جنسی اسپرم‌ها در انزال که به طور تئوری 1:1 است اما در عمل اینگونه نیست را دستخوش تغییر کند[31, 27, 8]. بررسی نسبت جمعیتی اسپرم‌های واجد کروموزوم X به اسپرم‌های واجد کروموزوم Y با استفاده از روش‌هایی نظیر فلوسیتومتری،PCR، Real-Time PCR و FISH انجام می‌گیرد[31،25، 17]. بدین منظور در این پایان‌نامه برآنیم که اثر دو عامل تنش گرمایی و تفاوت‌های فردی را روی تغییر نسبت جنسی اسپرم‌ها از 1:1 به مقداری متفاوت با استفاده از تکنیک Real-Time PCR بررسی کنیم. پیش‌بینی ما این است که اولاً در فصل گرما و در تنش گرمایی تعداد اسپرم‌های واجد کروموزوم Y نسبت به اسپرم‌های واجد کروموزوم Xدر انزال گاوها بیشتر است و ثانیاً این نسبت در گاوهای متفاوت با هم فرق دارد(تفاوت فردی)،در این تحقیق بررسی ما بر روی مایع منی 8 گاو است که یک بار در فصل گرما و یک بار در فصل سرما در آنها انزال صورت گرفته است،می‌باشد. آناتومی دستگاه تناسلی دام نر (Male Reproductive Anatomy) بخش‌های اساسی دستگاه تولیدمثل دام نر شامل اسپرماتیک کورد (بند بیضه)،اسکلروتوم (کیسه بیضه)،بیضه،اپیدیدیم،غدد ضمیمه تناسلی،آلت تناسلی می‌باشد[42, 37]، که به اقتضای پایان‌نامه به اختصار به هر یک اشاره خواهد شد. 1-1-1- اسپرماتیک کورد (بند بیضه) ساختاری طنابی شکل در جنس نر که توسط مجاری دفران و بافت‌های اطراف آن شکل گرفته است و از سمت شکم به هر بیضه می‌رسد و شامل انواع سرخرگ‌ها، اعصاب مختلف، شبکه پمپینی فورم، عروق لمفاتیکو عضله کرماستر و ... است[42، 37، 1]. 1-1-2- اسکروتوم (کیسه بیضه) در بسیاری از پستانداران از جمله گاوها، بیضه‌ها در حفره‌ای،بیرون از بدن قرار دارند که به آن اسکروتوم یا همان کیسه بیضه گفته می‌شود. در واقع این کیسه با یک دیواره به دو حفره تقسیم می‌شود و هر یک از بیضه‌ها در یکی از این حفرات قرار می‌گیرند. دیواره اسکروتوم شامل پوست رویی (ادامه پوست شکم)، ماهیچه‌ای به نام دارتوس و بخشی به نام تونیکا واژینالیس است. نقش این کیسه حفاظت از بیضه‌ها و تنظیم دمای مناسب برای عملکرد آنهاست. چرا که تولید اسپرم در بیضه‌ها حدود 7-4 درجه پایین‌تر از دمای بدن رخ می‌دهد[42, 1]. 1-1-2-1- ماهیچه دارتوس لایه‌ای است ماهیچه‌ای که در زیر پوست کیسه بیضه قرار دارد و با انقباض و انبساط خود،باعث می‌شود تا بیضه‌ها در هوای گرم به طرف خارج از بدن و در هوای سرد به طرف داخل بدن برای تنظیم درجه حرارت بیضه‌ها،کشیده شوند. این عضله غیر ارادی بوده و در دیواره بین دو نیمه راست و چپ اسکروتوم کشیده شده است[42, 1]. 1-1-2-2- تونیکا واژینالیس یک شبکه خونی که بیضه‌ها را پوشانده است. در واقع کیسه‌ای است از غشای حاوی سرم و حالت آبکی دارد. کنار قدامی به سطوح داخلی و خارجی هر بیضه را می‌پوشاند[37]. 1-1-3- بیضه‌ها بیضه‌ها در گاو بیضی شکل می‌باشند. طول آنها حدود 15-10 سانتی‌متر و عرض آنها حدود 8-5 سانتی‌متر است. این بیضه‌ها حدود 500-400 گرم وزن دارند. بیضه‌ها توسط طناب‌های اسپرماتیک در اسکروتوم معلق (آویزان) می‌باشند. این اندام دارای دو وظیفه اصلی است: 1- تولید اسپرم 2- تولید هورمون‌های جنسی نر (آندروژن‌ها) هر بیضه داخل یک بافت پیوندی سفید رنگی به نام تونیکا آلبوژینا است که خود توسط تونیکا واژینالیس پوشیده شده است و در قسمت کنار خلفی بیضه، به صورت یکتورفتگی عمودی و ناقص و ضخیم درمی‌آید که به آن ناف یا مدیاستینوم بیضه گفته می‌شود و عروق و مجاری بیضه از این قسمت وارد بیضه می‌شوند.تعداد زیادی سپتوم ناقص (ترابکول) از مدیاستینوم بیضه به درون آن نفوذ کرده و در نهایت داخل بیضه را به حدود 300-200 لوبول هرمی شکل تقسیم می‌کند. هر لوبول حاوی 3-2 عدد لوله اسپرم‌ساز پر پیچ و خم و بخشی به نام بافت بینابینی می‌باشد. در واقع لوله‌های اسپرم‌ساز حاصل نفوذ بخشی از کپسول به داخل بافت بیضه‌ها می‌باشند و حدود 70 تا 90 درصد وزن بیضه‌ها را تشکیل می‌دهند. انتهای لوله‌های اسپرم‌ساز در راس لوبول‌ها به صورت لوله مستقیم به هم می‌رسند و سپس وارد مدیاستینوم بیضه می‌شود. در مدیاستینوم بیضه،این لوله‌ها با هم پیوند (آناستوموز) شده و شبکه بیضه‌ای به نام رته تستیس را تشکیل می‌دهند(در مرکز بیضه) [42, 1]. سلول‌های تولیدکننده اسپرم (اسپرماتوگونیا) در سرتاسر غشای پایه لوله‌های اسپرم‌ساز قرار گرفته‌اند و توسط سلول‌های سرتولی محافظت می‌شوند. همانطور که سلول‌های اسپرمی تقسیم و بالغ می‌شوند از سمت غشا به لومن در لوله‌های اسپرم‌ساز جابجا می‌شوند و سپس به شبکه رته‌تستیس در مرکز بیضه منتقل می‌شوند تا به مجاری افران و سپس دفران برده شوند و از آنجا به اپیدیدیم بروند. بافت بینابینی دربرگیرنده عروق خونی،اعصاب و یک سری سلول‌های متمایز شده به نام سلول‌های لایدیگ می‌باشند که هورمون‌های جنسی تولید می‌کنند که به خون و سلول‌های سرتولی منتقل می‌شوند[15]. 1-1-4- اپیدیدیم اپیدیدیم ساختاری فشرده و پهنی است که در اتصال و نزدیکی یک سمت بیضه کشیده شده است. این لوله درهم پیچیده دارای 3 قسمت سر، تنه و دم می‌باشد. درون این لوله، حدود 160-130 توبول وجود دارد که نهایتاً به یک لوله به نام وازودفران ختم می‌شوند. حدوداً 45 تا 50 روز زمان لازم است تا اسپرم‌ها در لوله‌های اسپرم‌ساز شکل بگیرند و به اپیدیدیم وارد شوند و در آنجا بالغ و آماده برای انزال شوند[15]. حدود یک هفته از زمان گفته شده در اپیدیدیم سپری می‌شود تا اسپرم‌ها به اسپرم‌های بالغ و بارور تبدیل گردند[42, 15]. اسپرم‌ها که در اپیدیدیم ذخیره شده‌اند،نسبت به آن دسته که تازه وارد آن شدند و به عبارتی اخیراً شکل گرفته‌اند،به تنش‌های گرمایی مقاوم‌تراند. در مدت زمان 45 تا 50 روز که اسپرم‌ها در حال ساخته شدن هستند. قدرت باروری موجود نر کاهش خواهد داشت اما بعد از آن قدرت آن بسیار زیاد خواهد شد. از آنجایی که اپیدیدیم تنها مجرای خروجی اسپرم‌های تولید شده در بیضه می‌باشد،هرگونه انسداد آن اهمیت ویژه‌ای خواهد داشت. گاهی یک انسداد موقت که ایجاد تورم می‌کند. می‌تواند منجر به آسیب و عفونت گردد و نهایتاً عبور اسپرم‌ها را از این لوله مسئله‌ساز کند[42]. 1-1-5- غدد ضمیمه تناسلی این غدد در امتداد میزراه لگنی قرار گرفته‌اند. وظیفه آنها تولید مایعی است که وارد مجرای تناسلی شده و با اسپرماتوزوآ مخلوط می‌گردد و تشکیل مایع منی را می‌دهد. این غدد شامل آمپولا،وزیکول سمینال،پروستات و غدد کوپر می‌باشد[37, 1]. 1-1-5-1- آمپولا در قسمت انتهایی مجرای و ابران قرار گرفته است و کار آن ذخیره اسپرماتوئید و دخالت در تشکیل پلاسمای مایع منی است[37]. 1-1-5-2- وزیکول سمینال این غده در گاو حالت سفت و لوبوله دارد و در نزدیکی آمبولا در کف لگن قرار گرفته است. این غده دارای دو بخش است که طول هر یک 5-4 سانتی‌متر می‌باشد و هر کدام از طریق یک مجرا به میزراه می‌ریزند.ترشحات آن آبکی و شفاف است و مواد مغذی و بافری برای منی را فراهم می‌کند[42, 37]. 1-1-5-3- پروستات این غده در بخش گردن مثانه در کف لگن قرار گرفته است و به پیشابراه لگنی مربوط می‌شود. این غده ترشحاتش را به هنگام انزال به منی اضافه می‌کند. در گاو رشد کمی دارد و حجم ترشحاتش کم است[42, 37]. 1-1-5-4- کوپر یک جفت غده هستند که به صورت پشتی در پیشابراه لگنی کشیده شده‌اند. محکم و کوچک هستند و یکی از اعمال مهم ترشحات این غدد این است که میزراه را از باقی‌مانده ادرار که برای اسپرم‌ها مضر است،پاک می‌کند. این ترشحات معمولاً از آلت تناسلی در طول تحریکات جنسی بیرون می‌چکد[42, 37]. عفونت یکی از غدد ضمیمه باعث می‌شود رنگ مایع منی زرد یا تیره شود که علت آن وجود چرک و سلول‌های فاسد است. در گاو عفونت وزیکول سمینال شایع است. دریافت فایل بررسی نسبت جمعیتی اسپرم‌های واجد کروموزم X‌و Y تحت تأثیر برخی عوامل محیطی در گونه گاو با استفاده از تکنیک Real-Time PCR

دانلود فایل لایه (شیپ فایل) GIS کشورهای جهان

دانلود فایل لایه (شیپ فایل) GIS کشورهای جهان فایل لایه (شیپ فایل) GIS کشورهای جهان حجم فایل : 13 مگابایت دریافت فایل دانلود فایل لایه (شیپ فایل) GIS کشورهای جهان

بررسی درصد آلودگی پسته های آب خندان به قارچ Aspergillus flavus و آفلاتوکسین

بررسی درصد آلودگی پسته های آب خندان به قارچ Aspergillus flavus و آفلاتوکسین فهرست مطالب فصل اول.. 1 مقدمه‌:2 فصل دوم.. 5 بررسی منابع.. 5 تاریخچه درخت پسته.. 6 رده بندی گیاه شناسی:.. 7 سطح زیر کشت.. 7 کشت و تولید پسته در دنیا.. 7 سطح زیر کشت و تولید در ایران:.. 8 ارقام پسته.. 8 ارقام اروپایی.. 10 ارقام ایرانی.. 11 ارقام استان سمنان.. 11 خصوصیات درخت اوحدی: Owhadi12 خصوصیات درخت اکبری:Akbari13 خصوصیات درخت کله قوچی:Kaleh ghouchi15 خصوصیات درخت احمد آقایی:Ahmad aghei16 فنولوژی درختان پسته.. 18 ویژگیهای قارچها و اهمیت آنها در زندگی انسان.. 21 1-1- قارچها اجزای مهم اکوسیستم های طبیعی و تنوع زیستی.. 22 2-1- تخریب مواد غذایی، چوبی و فرآورده های دیگر.. 23 3-1- تولید آنتی بیوتیک و متابولیت های مفید و فعال زیستی جدید 24 4-1- قارچها، بعنوان مواد غذایی.. 25 5-1-کاربرد قارچها در صنایع تخمیری.. 25 6-1-تولید بیماری در گیاهان و حیوانات.. 26 7-1- قارچها، همزیست گیاهان و حیوانات.. 27 8-1قارچها، بعنوان عوامل کنترل بیولوژیک.. 28 9-1قارچها، بعنوان موجودات آزمایشگاهی با ارزش.. 29 تاریخچه و روندطبقه بندی قارچها.. 30 مقدمه ای برشاخهAscomycota. 36 مشخصات عمومی آسکومیکوتا.. 37 تولیدمثل غیر جنسی.. 39 تولید مثل جنسی.. 40 مراحل آسکوسپورزایی.. 43 شکل و ساختمان آسک.. 45 ساختار نوک آسک و مکانیزم آزاد شدن آسکوسپورها :.. 46 آسکوکارپ.. 47 انواع سنتروم.. 50 رده بندی آسکومیست ها.. 52 طبقه بندی قارچ آسپرژیلوس.. 57 خانواده تریکوکوماسه Trichocomaceae. 57 خصوصیات جنس Emericella. 59 طبقه بندی قارچ های حقیقی.. 62 میکروبیولوژی قارچ آسپرژیلوس.. 64 مرفولوژی((Morphology. 65 A. flavus link. 65 A. Parasiticus speare. 66 اکولوژی قارچ های آسپرژیلوس.. 67 عوامل موثربررشدقارچ وتولیدسم.. 70 نشانه ها و قارچ مولد.. 77 چرخه بیماری و ابیدمیولوژی.. 77 تعریف مایکوتوکسین و تاریخچه.. 79 تعریف و تاریخچه ی آفلاتوکسین.. 80 قوانین جهانی مربوط به مایکوتوکسین ها.. 83 خصوصیات آفلاتوکسین.. 84 توکسین های قارچیMycotoxins. 85 تاثیر آفلاتوکسین ها بر سلامت انسان.. 86 تاثیر آفلاتوکسین روی حیوانات.. 87 روش های سنجش و اندازه گیری آفلاتوکسین.. 88 فصل سوم.. 91 نمونه برداری.. 91 آماده سازی نمونه ها جهت کشت و تعیین میزان آلودگی به قارچ آسپرژیلوس و میزان آفلاتوکسین... 92 تهیه آب پیتون 1/ 0درصد.. 93 آماده کردن کلران فنینل کل.. 93 آماده کردن دی کلران.. 93 تهیه محیط کشت اختصاصی (AFPA).. 93 تهیه سوسپانسیون.. 94 کشت نمونه ها.. 95 فصل چهارم.. 96 بررسی مقایسه اختلاف میانگین تعداد کلنی های به قارچ آسپرژیلوس فلاووس در نمونه های پسته.. 96 شدت آلودگی نمونه های پسته به A.flavus. 97 استخراج آفلاتوکسین ازنمونه های پسته.. 98 رابطه کلنی زایی (تعداد کلنی در هر گرم پسته) و میزان آفلاتوکسین B1 در نمونه های پسته.. 99 بحث:.. 100 پیشنهادات.. 107 منابع وماخذ.. 108 فهرست تصاویر تصویر 1- 2خوشه پسته خنجری.. 12 تصویر2- 2رقم اوحدی.. 13 تصویر3- 2رقم اکبری.. 15 تصویر4- 2رقم کله قوچی.. 16 تصویر 5- 2رقم احمدی آقایی... 17 تصویر6-2روابط فیلوژنتیک بین سه انشعاب اصلی(شامل Archaea،Bacteria وEukaryota)موجودات زنده که دربرگیرنده سلسله های مختلف است(برگرفته ازKirk etal.2001).. 35 تصویر 7-2 تبدیل مستقیم سلول تخم(زیگوت)به آسک (ازمؤلف).. 41 تصویر 8-2– فرم غیر جنسی آسپرژیلوس فلاووس (اقتباس از کتاب سلسله قارچ ها .خداپرست ).. 61 تصویر شماره 1-3 : مرحله خسیانیدن.. 92 تصویر 2-3 – کلنی و نمونه جداسازی شده قارچ (میکروسکوپی ).. 93 تصویر شماره 3-3 مراحل آماده سازی و کشت نمونه.. 95 فهرست جداول جدول شماره 1-2درصدترکیبات شیمیایی مغز پسته دهان بست وخندان رقم فندقی ابراهیمی 17 جدول شماره 2-2:تعدادی از خصوصیات ارقام مورد مطالعه وتجاری در ایران 18 جدول(3-2) سلسله قارچها با پنج سلسله مهم دیگر مقایسه شده اند. 35 جدول 4-2 برخی از تلئمورف های مرتبط به جنس Aspergillus. 60 جدول5-2 خصوصیات افلاتوکسین. 86 جدول 1-4- مقایسه اختلاف میانگین تعداد کلنی های به قارچ آسپرژیلوس فلاووس در نمونه های پسته. 97 جدول شماره 2-4: تجزیه واریانس شدت آلودگی نمونه ها به آفلاتوکسین(ng/g) 98 جدول شماره3-4 بررسی میزان آلودگی تیمار ها به انواع آفلاتوکسین (B1 ، B2 ،G1و G2 ).. 99 جدول 4-4 ضریب همبستگی. 100 فهرست نمودار نمودار1-4-بررسی میزان آلودگی نمونه های پسته به قارچ آسپرژیلوس فلاووس 96 نمودارشماره2-4 ضریب همبستگی تعداد کلنی و مقدار آفلا توکسینB1 100 چکیده آلودگی میوه پسته به آفلاتوکسین از جمله مسائلی است که مشکلات زیادی در تولید،مصرف و صادرات پسته بوجود آورده است با توجه به اهمیت موضوع ، میزان آلودگی پسته های دهان بست و آب خندان و نیمه خندان به آفلاتوکسین مورد مطالعه و بررسی قرار گرفت.بمنظور مطالعه میزان آلودگی پسته های دهان بست و آب خندان به قارچهای گروه A. flavus وآفلاتوکسین. تعداد6 نمونه پسته دهان بست رقم احمد آقایی، یک نمونه بعنوان شاهد وپنج نمونه دیگر در مدت زمان های 1و2و3و4و5 روز در آب یخ خیسانیده شد . سپس بطور مکانیکی خندان و در آفتاب خشک گردید. یک نمونه آب خندان رقم احمد آقایی و یک رقم اکبری موجود در بازار و یک رقم پسته نیمه خندان خنجری(هر نمونه سه کیلو گرم ودر سه تکرار) تهیه و بمنظور تعیین میزان آلودگی به قارچ A. flavus،100گرم از هر نمونه مغز وسپس آسیاب وارزیابی انجام گرفت. نمونه ها پس از آسیاب به روش کشت رقتی در رقتهای 1 –10 و 2 – 10 در سطح پتری های حاوی محیط کشت اختصاصی (AFPA) Aspergillus Flavus Parasiticus Agarکشت گردید.3 تا 7 روز بعد از کشت کلنی های قارچ A. flavus رشد کرده در سطح پتریها شناسایی و شمارش گردید. و با شمارش کلنی های قارچ A. flavus در سطح پتری های مختلف ، اختلاف میانگین تعداد کلنی قارچ توسط آزمون چند دامنه ای دانکن در نمونه های مختلف با هم مقایسه شد. در سنجش میزان آلودگی به آفلاتوکسین، 27نمونه مورد ارزیابی قرار گرفت. اندارگیری میزان آفلاتوکسین موجود در نمونه های پسته به روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) انجام گرفت.نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد از 9 نمونه پسته مورد آزمایش، پسته های دهان بست و آب خندان احمد آقایی و اکبری هیچ گونه آلودگی به قارچ A.flavus و آفلاتوکسین نداشتند و پسته های نیمه خندان خنجری دارای بیشترین سطح آلودگی را به قارچ A.flavus وآفلاتوکسین نسبت به پسته های دهان بست وآب خندان نشان داده اند ومیزان آلودگی به آفلاتوکسین های B1،B2 ،G1 ،G2 چند برابر حد مجاز بود..تجزیه آماری داده ها نشان داد بین تیمار ها یا ارقام از لحاظ آلودگی به قارچ A.flavus وآفلاتوکسین در سطح احتمال 1% اختلاف معنی داری وجود دارد . واژه های کلیدی: پسته. آب خندان. دهان بست . قارچ آسپرژیلوس. آفلاتوکسین فصل اول کلیات مقدمه‌: پسته، میوه باستانی و با ارزش از گروه مغزه ها، در میان خشکبار به سلطان مغز ه ها شهره است. ارزش غذایی، خوشمزگی، راحتی هضم، کالری بالا، ویتامین ها و مواد معدنی مناسب، از ویژگی هایی است که پسته را در میان سایر مغزه ها برتر می نمایاند. بیش از 50 درصد کل محصول پسته جهان با متوسط سالیانه 235 هزار تن در سال متعلق به ایران است. که ضایعات آن بالغ بر 60 هزار تن است. صادرات پسته فقط از نوع خندان وتولید خلال پسته بوده و پسته های درجه 3 و4 و دهان بست حتی در داخل کشور بازار کمتری دارند.با وجود آنکه 5/6% کل تولید پسته کشور، حدود 15000 تن در سال، پسته های دهان بست است که هیچ گونه عملیات بهینه سازی و تولید محصولات فرعی جدید برای این نوع پسته انجام نشده است. از طرفی خواص تغذیه ای این قبیل پسته ها از انواع مرغوب آن کمتر نیست و می توان با بکارگیری تکنولوژی پیشرفته ارزش این نوع محصول را تا چند برابر افزایش داد. قارچهای گروه A. flavus از مهمترین گونه های این جنس می باشد که قادرند برروی طیف وسیعی از محصولات غذایی تولید متابولیتهای ثانویه تحت عنوان آفلاتوکسین نمایند، این ترکیبات بسیار سمی اند و سرطان زا بودن آنها اثبات شده است .این موارد همواره سلامت بشر را تهدید کرده و موجب مرگ و میر انسان ها و حیوانات می شود )محمدی مقدم 1390). از زمان کشف آفلاتوکسین، در دهه 1960،A .flavus به عنوان متداول ترین قارچ آلوده کننده مواد غذایی در منابع علمی همواره ذکر گردیده است،که نشانگر اهمیت اقتصادی این قارچ می باشد. این قارچ تمایل ویژه ای برای آلودگی دانه های آجیلی و روغنی و غلات از خود نشان می دهد. بادام زمینی، ذرت، گندم، برنج، پسته، و بادام از عمده ترین محصولاتی هستند که به وسیله این قارچ مورد تهاجم قرار می گیرند. ارزش اقتصادی حاصله از صادرات پسته در ایران بیش از یک میلیارد دلار در سال می باشد که دومین منبع درآمد ارزی بعد از نفت محسوب می شود که این خود گواه بر اهمیت فوق العاده این محصول است که نیاز مبرم به بهینه سازی یشتر محصول در سطح جهانی دارد. تاکنون 18 نوع آفلاتوکسین شناسایی و ذکر شده است که از میان آنها 13 نوع آفلاتوکسین هایی هستند که به طور طبیعی تولید می شوند. عمده ترین این ترکیبات آفلاتوکسین های B1، B2، G1، G2 می باشند (شهیدی1357). آفلاتوکسین ها یک گروه ساختاری می باشند که جزء متابولیت های ثانویه به شمار می روند(علوی 1383). تحقیقات حول موضوع آلودگی به آفلاتوکسین ابتدا در خصوص قارچ شناسی پس از برداشت، بیماری شناسی و سم شناسی متمرکز گردید. هر چند که در اواسط دهه 1970 آلودگی به آفلاتوکسین در مرحله پیش از برداشت در محصول ذرت در ایالات متحده و هندوستان کشف شد. و در دهه حاضر، آفلاتوکسین به خاطر آن که ذرت دانه ای ،بادام زمینی، مغزیات درختی و تخم کتان را پیش از برداشت آلوده می کند مورد توجه قرار گرفته و به شکل مشکلی حاد در آمده است، در حال حاضر، بالغ بر50 کشور محصولات غذایی انسان وخوراک دام را از لحاظ بروز آلودگی به مایکوتوکسین ها به ویژه آفلاتوکسین تحت نظارت دارند به طور معمول، مقررات خاصی در مورد مواد خام و فرآوری شده اعمال می گردد. امروزه آلودگی محصولات کشاورزی به آفلاتوکسین ها یکی از مهمترین مشکلات بهداشت جامعه جهانی بوده و کشور های مختلف با توجه به خطرات جدی مایکوتوکسین ها، مقررات ویژه ای برای تولید، مصرف و واردات مواد غذایی تنظیم نموده اند و اکثر کشور ها حساسیت ویژه ای نسبت به آلودگی مواد غذایی به قارچهای جنس Aspergilusو آفلاتوکسین حاصل از آن دارند (علامه و رزاقی،1381) از سال 1971 که بخشی از پسته صادراتی ایران و ترکیه به دلیل آلودگی در آمریکا توقیف شد آفلاتوکسین اهمیت زیادی در محصولات خشکباری ایران پیدا کرد. پس از برگشت محموله پسته صادر شده به آمریکا به دلیل آلودگی به آفلاتوکسین این مسئله در مراکز تحقیقاتی کشور مورد توجه قرار گرفت.بنابر این با توجه به اهمیت موضوع ،جنبه های مختلف موضوع آلودگی پسته به قارچ A.flavus و آفلاتوکسین باید به طور جد مورد مطالعه و برسی قرار گیرد. دریافت فایل بررسی درصد آلودگی پسته های آب خندان به قارچ Aspergillus flavus و آفلاتوکسین

بررسی نقش گیرنده 5-HT1A بر تقویت پتانسیل های میدانی شکنج دندانه دار در مدل صرعی کیندلینگ موش صحرایی

بررسی نقش گیرنده 5-HT1A بر تقویت پتانسیل های میدانی شکنج دندانه دار در مدل صرعی کیندلینگ موش صحرایی فهرست مطالب عنوان صفحه فصل اول: کلیات 1-1-مقدمه 3 فصل دوم:مروری بر مطالعات انجام شده 2-1- صرع 7 2-1-1- تقسیم بندی انواع صرع 8 2-1-2- مکانیسم های ایجاد صرع 9 2-1-3- آناتومی عملکردی صرع لیمبیک 10 2-1-4- مدل های آزمایشگاهی ایجاد صرع 11 2-2- کیندلینگ 11 2-2-1- انواع کیندلینگ 12 2-2-2-کیندلینگ پنتیلن تترازول 13 2-2-3- تقویت سیناپسی 13 2-2-4- تقویت سیناپسی ناشی از PTZ 14 2-2-5- مراحل مختلف تشنج های ناشی از کیندلینگ 15 2-3- تشکیلات هیپوکمپ 16 2-3-1-نقش هیپوکمپ در تشنج 17 2-3-1-1-ارتباطات شکنج دندانه دار 17 2-3-1-2-شکنج دندانه دار و کیندلینگ 18 2-4-نقش نوروترانسمیترها در صرع 19 2-4-1- استیل کولین 19 2-4-2-نوراپی نفرین 20 2-4-3-گابا(GABA) 20 2-4-4- اسیدهای آمینه تحریکی 21 2-4-5- آدنوزین 21 2-4-6- دوپامین 22 2-4-7- سروتونین 22 2-5- سیستم سروتونرژیک و صرع 23 فصل سوم:مواد و روش ها 3-1- آماده سازی مواد و وسایل لازم 26 3-1-1- تهیه الکترود 26 3-1-2- تهیه کانول 26 3-1-3- آماده سازی دارو 27 3-1-3-1- داروی مورد استفاده 27 3-1-3-2- تهیه دوزهای مختلف دارو 27 3-2- جراحی حیوانات 27 3-3- تحریک حیوانات 28 3-4- ثبت پتانسیلهای میدانی 29 3-5- روش تزریق دارو 29 3-6- کیندلینگ حیوانات بوسیله PTZ 30 3-7-گروههای آزمایشی 30 3-8- روش تجزیه و تحلیل آماری 32 فصل چهارم:نتایج 4-1- تأیید بافت شناسی 34 4-2- نتایج آزمایش اول 35 4-2-1- اثر اعمال تحریک تتانیک بر پتانسیل های میدانی در حیوانات دست نخورده(بدون تزریق PTZ) 36 4-3- نتایج آزمایش دوم 37 4-3-1- بررسی نقش گیرنده های سروتونین بر اثر بخشی تحریک تتانیک در حیوانات کیندل (با تزریق PTZ) 37 4-3-2- بررسی تزریق آنتاگونیست گیرنده ی 5-HT1A سرتونینی ((WAY-100635 با غلظت 5/12 نانومولار بر اثر بخشی تحریک تتانیک در حیوانات کیندل 40 4-3-3- بررسی تزریق آنتاگونیست گیرنده ی 5-HT1A سرتونینی ((WAY-100635 با غلظت 25 نانومولار بر اثر بخشی تحریک تتانیک در حیوانات کیندل 41 4-3-4-بررسی تزریق آنتاگونیست گیرنده ی 5-HT1A سرتونینی ((WAY-100635 با غلظت 50 نانومولار بر اثر بخشی تحریک تتانیک در حیوانات کیندل 43 4-4-مقایسه دوزهای مختلف آنتاگونیست گیرنده ی 5-HT1A سرتونینی (WAY-100635)در اثر بخشی LTP 46 فصل پنجم:بحث، نتیجه گیری و پیشنهادات 5-1- بحث و بررسی 48 5-2-نتیجه گیری 52 5-3- پیشنهادها 53 منابع References 54 فهرست جدول ها عنوان صفحه جدول2-1: تقسیم بندی انواع صرع بر اساس نامگذاری مجمع بین المللی مبارزه با صرع 9 فهرست شکل ها عنوان صفحه شکل2-1: جایگاه هیپوکمپ در مغز انسان 17 شکل2-2: نمایی از ورودی و خروجی های شکنج دندانه دار. 18 شکل2-3: ساختار شیمیایی شماتیک سروتونین 23 شکل3-1: نمونه ای از ثبت پتانسیل میدانی ناحیه شکنج دندانه دار پس از تحریک تک پالس 29 شکل3-2: نحوه تزریق دارو به داخل بطن جانبی با استفاده از پمپ تزریق (a) و سرنگ هامیلتون (b) 30 شکل3-3: پروتوکل زمانی گروه1(غیرکیندل)از آغاز جراحی تا آخرین ثبت گرفته شده. 31 شکل3-4: پروتوکل زمانی گروه2(کنترل کیندل)از آغاز جراحی تا آخرین ثبت گرفته شده. 31 شکل3-5: پروتوکل زمانی گروه های 3 ، 4 و 5(گروه های درمان کیندل) از آغاز جراحی تا آخرین ثبت گرفته شده. 32 شکل 4-1 : موقعیت شکنج دندانه دار در مغز انسان. 34 فهرست نمودارها عنوان صفحه نمودار1-2-4 A اثر اعمال تحریک تتانیک بر دامنه اسپایک های تجمعی در گروه1 (غیر کیندل). 36 نمودار1-2-4 B اثر اعمال تحریک تتانیک بر شیب پتانسیل های میدانی در گروه1 (غیر کیندل). 37 نمودار1-3-4 A اثر اعمال تحریک تتانیک بر دامنه اسپایک های تجمعی در گروه 2(کنترل کیندل). 38 نمودار1-3-4 B اثر اعمال تحریک تتانیک بر شیب پتانسیل های میدانی در گروه2( کنترل کیندل). 38 نمودار1-3-4 C درصد تغییرات دامنه اسپایکهای تجمعی قبل و بعد ازاعمال تحریک تتانیک در گروه 1و2(غیر کیندل و کنترل کیندل). 39 نمودار 1-3-4 D درصد تغییرات شیب پتانسیل های میدانی قبل و بعد ازاعمال تحریک تتانیک در گروه1و2(غیر کیندل و کنترل کیندل). 39 نمودار2-3-4 A اثر تزریق آنتاگونیست گیرنده ی 5-HT1A سرتونینی ((WAY-100635 با غلظت 5/12 نانومولار و اعمال تحریک تتانیک بر دامنه اسپایک های تجمعی در گروه 3(WAY12.5). 40 نمودار2-3-4 B اثر تزریق آنتاگونیست گیرنده ی 5-HT1A سرتونینی ((WAY-100635 با غلظت 5/12 نانومولار و اعمال تحریک تتانیک بر شیب پتانسیل های میدانی در گروه 3(WAY12.5). 41 نمودار 3-3-4 A اثر تزریق آنتاگونیست گیرنده ی 5-HT1A سرتونینی ((WAY-100635 با غلظت 25 نانومولار و اعمال تحریک تتانیک بر دامنه اسپایک های تجمعی در گروه 4(WAY25). 42 نمودار 3-3-4 B اثر تزریق آنتاگونیست گیرنده ی 5-HT1A سرتونینی ((WAY-100635 با غلظت 25 نانومولار و اعمال تحریک تتانیک بر شیب پتانسیل های میدانی در گروه 4(WAY25). 42 نمودار 4-3-4 A اثر تزریق آنتاگونیست گیرنده ی 5-HT1A سرتونینی ((WAY-100635 با غلظت 50 نانومولار و اعمال تحریک تتانیک بر دامنه اسپایک های تجمعی در گروه 5(WAY50). 43 نمودار 4-3-4 B اثر تزریق آنتاگونیست گیرنده ی 5-HT1A سرتونینی ((WAY-100635 با غلظت 50 نانومولار و اعمال تحریک تتانیک بر شیب پتانسیل های میدانی در گروه 5(WAY50). 44 نمودار 4-3-4 C در صد تغییرات دامنه اسپایک های تجمعی(PS)گروه های کیندل قبل از تزریق دارو و بعد اعمال تحریک تتانیک. 45 نمودار 4-3-4 D در صد تغییرات شیب پتانسیل های میدانی(fEPSP) گروه های کیندل قبل از تزریق دارو و بعد اعمال تحریک تتانیک. 45 فهرست علامت‌ها و اختصارها پتانسیل های پس سیناپسی میدانی Field Excitatory Post-synaptic Potential fEPSP پتانسیل های میدانی تک پالس Local Field Potential LFP تقویت سیناپسی طولانی مدت Long Term Potentiation LTP اسپایک تجمعی Population Spike PS پنتیلن تترازول Pentylenetetrazol PTZ چکیده با وجود تحقیقات گسترده در زمینه صرع و تشنج در حدود 75 درصد موارد، دلایل ایجاد تشنج روشن نیست. اما شواهد زیادی وجود دارد که نشان می دهد سیستم سرتونرژیک و تحریک گیرنده های سروتونینی شدت حملات تشنجی را کاهش می دهد و شروع تشنجها را به تأخیر می اندازد. با توجه به نقش گیرنده سروتونینی 5-HT1A در فعالیت سیناپسی و در نتیجه اهمیتی که در مدل های تشنجی دارد، از طرفی با توجه به تشابه مکانیسم های در گیر در ایجاد حملات تشنجی و تقویت طولانی مدت (Long Term Potentiation; LTP) هدف از مطالعه حاضر بررسی نقش این گیرنده در تقویت سیناپسی ناشی از پنتیلن تترازول (Pentylenetetrazol; PTZ) است. بنابراین آزمایشات بدین ترتیب طراحی شد:20 سر موش صحرایی نر نژاد ویستار با وزن 320-220 در پنج گروه به صورت تصادفی تقسیم شدند؛ گروه1 (غیر کیندل): بدون هیچ مداخله ای برای جراحی استرئوتاکسیک آماده شدند. پس از قرار دادن الکترودهای تحریک و ثبات در مکان های مشخص شده، به مدت 20 دقیقه ثبت پایه پتانسیل های میدانی با تک پالس انجام گردید. پس از ثبت پتانسیل های میدانی تحریک تتانیک جهت ایجاد LTP القا شد. پس از اعمال تحریک تتانیک، دوباره ثبت پتانسیل های میدانی به مدت 20 دقیقه انجام گرفت. گروه 2 (کنترل کیندل): تمام مراحل انجام آزمایش مشابه گروه اول بود با این تفاوت که حیوانات قبل از جراحی طی دوره یک ماهه تزریق PTZ کیندل شده بودند. گروه 3تا5(گروه های درمان کیندل): مراحل انجام آزمایش مشابه گروه دوم بود با این تفاوت که آنتاگونیست گیرنده ی 5-HT1A سرتونینی (WAY-100635) با غلظت 5/12، 25 و 50 نانومولار تزریق داخل بطنی می شد. همچنین بعد از تزریق آنتاگونیست و قبل از القای LTP 20 دقیقه ثبت پتانسیل های میدانی نیز گرفته می شد.بخش اول نتایج نشان داد که تحریک تتانیک شیب پتانسیل های میدانی (fEPSP) و دامنه اسپایک های تجمعی(PS) را به طور معناداری افزایش می دهد. گروه غیر کیندل و کنترل کیندل پس از اعمال تحریک تتانیک به منظور ایجاد LTP به طور معنی داری متفاوت از یکدیگر پاسخ دادند (p<0.001). همچنین بخش دیگر نتایج نشان داد که تزریق WAY-100635 (با غلظتهای 5/12، 25 و 50 نانومولار) در گروه های 3 تا 5 نسبت به گروه 2، fEPSP و PS به طور معناداری کاهش پیدا کرد(p<0.001).نتایج کار نشان داد که القای LTP در حیوانات صرعی در حضور آنتاگونیست سرتونینی 5-HT1A تضعیف می شود به نظر می رسد که آگونیست سروتونینی القای LTP را تقویت و در نتیجه ممکن است در تقویت حافظه و یادگیری افراد صرعی مفید باشد. کلمات کلیدی: صرع، کیندلینگ، آنتاگونیست گیرنده 5-HT1A، تحریک تتانیک فصل اول: کلیات 1-1-مقدمه صرع یکی از اختلالات رایج عصبی است که دانش بشری در مورد مکانیسم های ایجاد و درمان قطعی آن هنوز ناقص می باشد. از اینرو با استفاده از مدل های آزمایشگاهی ایجاد تشنج، مطالعات فراوانی در حال انجام است. یکی از مدل های ایجاد تشنج، کیندلینگ است که در آن با تحریک مکرر ناحیه خاصی از مغز در حیوانات آزمایشگاهی تشنج ایجاد می شود. به کمک این مدل آزمایشگاهی می توان نحوه ارتباط بین نواحی مختلف مغزی را بررسی کرد، و نقش داروها و مواد شیمیایی مختلف را بر تشنج ایجاد شده در یک ناحیه مشخص مورد بحث قرار داد. کیندلینگ بهترین مدل برای ایجاد تشنجات موضعی پیچیده می باشد(ستو و همکاران،1990)؛ در تشنج های موضعی پیچیده منشا ایجاد تشنج معمولا لوب گیجگاهی و سیستم لیمبیک است(گلور،1992؛ فیشر،1989). شایع ترین نوع صرع در انسان صرع لوب گیجگاهی است(انجل، 1998). در این نوع صرع هیپوکمپ نقش مهمی در عمومی شدن تشنجات دارد. به علاوه نشان داده شده که در صرع لوب گیجگاهی، فیبرهای خزه ای (آکسون سلول های گرانولی شکنج دندانه دار) به مقدار زیاد شروع به جوانه زدن کرده و لایه های سوماتیک و مولکولی شکنج دندانه دار را عصب دهی می کنند(کوهن و همکاران،2003). در میان نواحی مختلف مغز، شکنج دندانه دار به عنوان بخشی از تشکیلات هیپوکمپ نقش مهمی در صرع لوب گیجگاهی دارد و یکی از نواحی حساس برای ایجاد کیندلینگ است(انج و همکاران،2006؛ موریموتو و همکاران،2004). کیندلینگ باعث تقویت مدارهای مهاری و تحریکی در این ناحیه می شود(آدامک و همکاران،1981؛ دیجنگ و راسین،1987؛ مارو و گودارد،1987؛ گیلبرت، 1991) به طور مثال، نشان داده شده است که کیندلینگ شیب پتانسیل های پس سیناپسی میدانی و دامنه اسپایک های دسته جمعی را افزایش می دهد (روبینسون و همکاران، 1991؛ روتریچ و همکاران، 2001). با وجود تحقیقات گسترده در زمینه صرع و تشنج در حدود 75 درصد موارد، دلایل ایجاد تشنج روشن نیست(زاروسکی و همکاران،2007). اما شواهد زیادی وجود دارد که نشان می دهد سیستم سرتونرژیک و تحریک گیرنده های سروتونینی شدت حملات تشنجی را کاهش می دهد و شروع تشنجها را به تأخیر می اندازد(لازارووا و همکاران،1979؛ لوسچر و همکاران،1985؛ یان و همکاران،1994). در مطالعاتی که در مورد اثر آنتاگونیست گیرنده های سروتونینی صورت گرفت نشان داده شد که آنتاگونیست گیرنده های 5HT2A, 5HT3, 5HT2B,C آستانه تشنجات ناشی از کیندلینگ شکنج دندانه دار را تغییر نمی دهند؛ اما آنتاگونیست گیرنده 5-HT1A شدت تشنجات را افزایش می دهد(واتاناب و همکاران،2000). پنتیلن تترازول به عنوان آنتاگونیست گیرنده GABAA، یک ماده شیمیایی تشنج زاست. تزریق متناوب غلظتی از این دارو که در ابتدا به تشنج منجر نمی شود، به عنوان روشی برای تهیه مدل های حیوانی مطالعات مربوط به صرع به کار برده می شود. این ماده شیمیایی تشنج زا، تغییرات بیوشیمیایی ویژه ای در هیپوکمپ به بار می آورد که ماندگار به نظر می رسند(پریسیک و همکاران،2005). تحقیقات نشان داده است که مکانیسم هایی که طی ایجاد LTP در سیستم عصبی رخ می دهد، مشابه مکانیسمهایی است که در طی روند ایجاد مدلهای تشنجی صرع (مانند کیندلینگ) بوجود می آید. از اینرو عده ای از دانشمندان LTP را به عنوان پایه و اساس عصبی پدیده ی کیندلینگ فرض کرده اند. LTP در واقع صورتی از شکل پذیری سیناپسی است که بار اول در هیپوکمپ مشاهده شد و LTP هیپوکمپی در سال های اخیر به عنوان مدل غالب شکل پذیری سیناپسی وابسته به فعالیت در مغز پستانداران مطرح شده است. با توجه به نقش گیرنده سروتونینی 5-HT1A در فعالیت سیناپسی و در نتیجه اهمیتی که در مدل های تشنجی دارد، از طرفی با توجه به تشابه مکانیسم های در گیر در ایجاد حملات تشنجی و تقویت طولانی مدت LTP)) هدف از مطالعه حاضر بررسی نقش این گیرنده در تقویت سیناپسی ناشی از پنتیلن تترازول (PTZ) است. هدف از طراحی این پژوهش بررسی نقش گیرنده 5-HT1A بر فعالیت سیناپس های ناحیه شکنج دار موش های تشنجی می باشد. یکی دیگر از اهداف فرعی این تحقیق بررسی نقش این گیرنده ها بر تشنج است؟ آیا مدت زمان تشنج را کاهش می دهد؟ آیا اثر این گیرنده ها در سیناپس های تشنجی و معمولی متفاوت است؟ فصل دوم: مروری بر مطالعات انجام شده 2-1- صرع بقراط اولین بار صرع را یک اختلال مغزی معرفی کرد. صرع یکی از رایج ترین اختلالات عصبی در انسان می باشد، و هنوز روش قطعی درمان آن شناخته نشده است. داروهای ضد صرع موجود فقط در 40 درصد موارد، تشنج را از بین می برند؛ و در بقیه موارد فقط فراوانی وقوع تشنج ها را کم می کنند(جاسپر،1969). درمان جراحی نیز تنها در صورت تک کانونی بودن صرع قابل استفاده است و عوارض غیر قابل برگشتی را به دنبال دارد. مطابق با آمارهای انجام شده، شیوع صرع در جمعیت انسانی حدود 3% است(بات و گاردینر،1999). به طور کلی، به فعالیت الکتریکی غیر طبیعی، همزمان و آشفته دسته ای از نورون ها در مغز تشنج گفته می شود. اگر این اختلال باعث تغییری ناگهانی و گذرا در رفتار شخص شود، به آن تشنج می گویند؛ و اگر این حملات تشنجی بدون علل زمینه ای و به طور تکراری رخ دهد، به آن صرع گفته می شود. صرع به اشکال مختلف شامل: آشفتگی در رفتار، حس، حرکت و ادراک دیده می شود. این آشفتگی ها ممکن است با تغییر در سطح هوشیاری همراه باشد(دیروک،2007). شایع ترین عواملی که ممکن است در ایجاد صرع دخیل باشند عبارت اند از: کمبود اکسیژن، مننژیت باکتریایی ، ضربه های مغزی، تومورهای مغزی، سوء استعمال داروها یا الکل، عفونت های مغزی و نقایص ژنتیکی می باشد (فیشر،1989؛ نامارا و همکاران،1980). شناخت مکانیسم های ایجاد صرع از قدیم یکی از موضوعات مورد تحقیق بشر بوده است. در قدم های اولیه، تغییر در آستانه تحریک پذیری مغز را علت صرع بیان می کردند، اما با پیش رفت تکنیک های دقیق الکتروفیزیولوژی مشخص گردید هنگام بروز صرع، در فعالیت نورون ها یا گیرنده ها و کانال های یونی نواحی خاصی از مغز، اختلال ایجاد می شود. هم اکنون بررسی علل این اختلافات و چگونگی مقابله با آن ها در دست تحقیق می باشد. 2-1-1- تقسیم بندی انواع صرع به منظور شناخت دقیق تر و درمان بهتر افراد صرعی، بر اساس نوع رفتار تشنجی، صرع را تقسیم بندی می کنند. "مجمع بین المللی مبارزه با صرع" در سال 1981، بر اساس نشانه های بالینی و الگوهای الکتروانسفالوگرام، صرع را به سه نوع: موضعی، عمومی، و طبقه بندی نشده تقسیم بندی نمود(دیروک،2007). نزدیک به 60درصد افراد مصروع، صرع موضعی دارند. در تشنج های موضعی، فعالیت تشنجی از یک ناحیه از مغز یا نیمکره مغزی شروع می شود، که می تواند به صورت عمومی درآید. هنگام بروز این نوع تشنج ها علایم حسی، حرکتی، اتونومیک و یا روانی ممکن است بروز کند. بسته به ناحیه درگیر و شروع کننده یکی از این نوع علایم ظاهر می شوند (گودارد،1967). اولین علامت تشنج های موضعی اورا است که یک علامت هشدار دهنده از قبیل احساس ترس یا یک بوی خاص می باشد(نامارا و همکاران،1994). تشنج های موضعی به دو نوع ساده و پیچیده تقسیم می شوند؛ در صرع موضعی ساده، فرد مصروع هوشیار باقی می ماند و احساس هایی غیرعادی تجربه می کند. برخلاف صرع موضعی ساده، در صرع موضعی پیچیده هوشیاری از دست می رود که بین چند ثانیه تا چند دقیقه طول می کشد، ولی به ندرت احساس هایی غیرعادی تجربه می کند. در صرع لوب گیجگاهی، که از نوع تشنج های موضعی پیچیده بوده و شایع ترین نوع صرع در بالغین است(رال و اسچلیفر؛1981)، تشنج به طور ثانویه عمومی می گردد و چون کانون های تشنج در این نوع صرع از ساختمان های لوب گیجگاهی منشا می گیرند، به این نام خوانده می شوند. در بیشتر بیماران مبتلا به صرع لوب گیجگاهی، ساختارهای لوب گیجگاهی میانی از جمله تشکیلات هیپوکمپ، ناحیه تولید کننده تشنجات می باشد(گودارد،1967). این تشنجات درصد زیادی از حملات صرعی را شامل می شوند و غالبا به دارو درمانی مقاوم هستند(نامارا،1994). تشنج های موضعی در صورتی که به خوبی درمان نشوند به تشنج های عمومی تبدیل می گردند. تشنجات عمومی کانون مشخصی ندارند و نواحی وسیعی از هر دو نیمکره مغزی را شامل می شوند. براساس الگوی رفتاری این نوع حملات به گروه های مختلفی از جمله: صرع کوچک، تونیک، کلونیک، و تونیک-کلونیک (یا صرع بزرگ) تقسیم می شوند. جدول2-1: تقسیم بندی انواع صرع بر اساس نامگذاری مجمع بین المللی مبارزه با صرع Partial Simple partial Motor Sensory Sensory-motor Autonomic Cognitive Complex partial Secondary generalized Generalized Tonic-clonic (grand mal) Absence (petit mal) Myoclonic Tonic Clonic Atonic Unclassified تشنجات طبقه بندی نشده آن دسته از تشنجاتی هستند که در هیچکدام از گروه بندی های فوق جای نمی گیرند(رال و اسچلیفر،1981؛ شربورن و کورتیس،1990) جدول(2-1). 2-1-2- مکانیسم های ایجاد صرع عوامل متعددی در ایجاد صرع دخیل هستند، که شامل مکانیسم های درون سلولی (مربوط به غشای نورون ها) و مکانیسم های خارج سلولی (مربوط به الکترولیت ها و عوامل خارجی) می باشد. این دو مکانیسم می توانند منجر به تحریک پذیری زیاد نورون های مغزی شده و فعالیتی همزمان و کلیشه ای در این نورون ها ایجاد کنند که به آن ها PDS گفته می شود. PDS یک موج دپلاریزه کننده نسبتا بزرگ (20-40mv) و طولانی مدت (100ms) می باشد، که متعاقب آن یک مرحله هیپرپلاریزاسیون دیده می شود. مرحله دپلاریزاسیون به واسطه فعال شدن کانال های non-NMDA، NMDA و کانال های کلسیمی وابسته به ولتاژ به وجود می آید و مرحله هیپرپلاریزاسیون به واسطه فعال شدن کانال های پتاسیمی حساس به ولتاژ و حساس به کلسیم و نیز کانال های کلری GABA رخ می دهد. کاهش کلسیم مایع بین سلولی مغز و یا افزایش غلظت پتاسیم در آن که ناشی از عملکرد نامطلوب سلول های گلیاست، می تواند منجر به بروز PDS شود (دلگادواسکواتا و همکاران،1999). اگر نورون های موجود در کانون تشنج که فعالیت غیر طبیعی دارند، تعدادشان کمتر از هزار عدد باشد، هیچگونه تظاهرات بالینی دیده نمی شود. این فعالیت الکتریکی غیر طبیعی فقط به شکل اختلالاتی در الکترو انسفالوگرامEEG قابل ثبت می باشد. مهم ترین نشانه الکتروفیزیولوژی صرع، ثبت اسپایک های غیر طبیعی در EEG است.اگر این اسپایک ها در زمان وقوع حملات صرع ثبت شوند به آن ها اسپایک های حمله ای و اگر در مراحل بین حملات صرعی ثبت شوند به آن ها اسپایک های بین حمله ای گفته می شود. اسپایک های حمله ای همیشه با بروز رفتار تشنجی همراه هستند، ولی اسپایک های بین حمله ای رفتار تشنجی ایجاد نمی کنند. فرآیند PDS زمینه ساز اسپایک های حمله ای می باشد. منشا PDS و اسپایک های حمله ای ممکن است؛ حذف مهار پیرامونی، افزایش فرکانس پتانسیل های پس سیناپسی تحریکی(EPSP)، افزایش ثابت زمانی در دندریت های نورون های پس سیناپسی، القای میدان الکتریکی، فعالیت گیرنده های (NMDA) و کاهش فعالیت سیستم (GABA) باشد (دلگادواسکواتاو همکاران،1999). 2-1-3- آناتومی عملکردی صرع لیمبیک منظور از آناتومی عملکردی صرع لیمبیک، تمام مدار های موضعی است که به هنگام ایجاد این نوع صرع باعث شروع، تعدیل، همزمان سازی و انتشار آن به سایر نواحی مغزی می شوند. در انسان صرع لوب گیجگاهی شایع ترین نوع صرع است و منشا آن تمام بافت هایی هستند که در زیر شیار سیلوین و در زیر لوب گیجگاهی و آهیانه قرار دارند. این ساختارها شامل هیپوکمپ ، آمیگدال، قشر پاراهیپوکمپ، قشر پیریفورم و دیگر ساختارهای قشر لیمبیک است که منشا صرع لوب گیجگاهی در انسان می باشند(اجمان،2001؛ اوموری و همکاران،1999). حساسیت بخش های مختلف لوب تمپورال به صرع متفاوت است. وایزر(1987) نشان داد که در لوب تمپورال دو ساختار، کانون اصلی صرع می باشند: یکی آمیگدال و دیگری هیپوکمپ. وی نتیجه گرفت که در 25درصد افراد مصروع کانون صرع در هیپوکمپ، 10% در آمیگدال و 65% در هر دو هسته است(اینتایر و همکاران،2005). 2-1-4- مدل های آزمایشگاهی ایجاد صرع مدل های آزمایشگاهی ایجاد صرع باید دارای ویژگی های خاص باشد. چند مورد از این ویژگی ها عبارتند از: الف) نوع حملات از لحاظ بالینی باید مشابه حملاتی باشد که در صرع انسانی اتفاق می افتد. در انسان حملات موضعی پیچیده از نوع حملات مقاوم به دارو هستند. بنابراین این نوع حملات باید بیشتر مورد مطالعه قرار گیرد. ب) حملات ایجاد شده باید همراه با تغییراتی در الکتروانسفالوگرام باشد، به طوری که تغییر در الکتروانسفالوگرام را مؤید تظاهرات رفتاری در نتیجه اثر دارو دانست. ج) داروهای ضد صرعی استاندارد مورد استفاده باید دارای اثرات ضعیف بر حملات باشند. بدین ترتیب می توان اثرات داروهای مختلف را مقایسه کرد. چرا که بعضی از داروها اثر بیشتری از داروهای استاندارد بر روی حملات دارند، و از طرفی می توان از مدل های دیگر جهت مطالعات اثرات ضد تشنجی این دارو کمک گرفت. د) مدل آزمایشگاهی باید طوری انتخاب شود، که حالت تشنجی برای مدتی باقی بماند تا بتوان اثر داروهای ضد تشنجی را در زمان های مختلف پس از به کار بردن دارو بررسی کرد (لوسچر،1997). تا کنون از مدل های شیمیایی و ژنتیکی گوناگونی برای ایجاد تشنج و صرع استفاده شده است. الکتروشوک، مدل های شیمیایی و ژنتیکی ایجاد تشنج و کیندلینگ از مدل های رایج فعلی می باشند. در این میان مدل کیندلینگ بیشترین تشابه را با حالت صرع در انسان دارد، و در آزمایشگاه های تحقیقاتی مختلف به عنوان مدل ایجاد تشنج مزمن مورد استفاده قرار می گیرد. 2-2- کیندلینگ کیندلینگ مدلی آزمایشگاهی برای ایجاد صرع لوب گیجگاهی می باشد. در این مدل، حیوان آزمایشگاهی با محرک ضعیفی که در ابتدا قادر به ایجاد تشنج نمی باشد، در فواصل زمانی مشخصی تحریک می شود و به تدریج و با گذشت زمان، این تحریک ضعیف تشنج ایجاد می کند. سویلانو و دلگادو(1961) نشان دادند که تحریک الکتریکی با جریان های پایین به هیپوکمپ باعث یک فعالیت تشنجی پیشرونده می شود(نامارا و همکاران،1980).اولین بار گودارد (1969) به اهمیت این پدیده پی برد و اصطلاح کیندلینگ را، که به معنی شعله ور شدن می باشد، برای این پدیده به کار برد. وی کیندلینگ را به عنوان یک مدل برای صرع زایی، یادگیری و حافظه مطرح کرد. در حین فرآیند کیندلینگ تخلیه های الکتریکی از موضع تحریک به نواحی دیگر در مغز منتشر شده و فعالیت آن نواحی را به گونه ای تغییر می دهد که علائم حرکتی تشنج بوجود می آید. این پاسخ های حرکتی به تدریج عمومی و فراگیر می شوند. اگر تحریکات منحصر به نواحی قشر لیمبیک نظیر آمیگدال یا هیپوکمپ باشد نمی توانند باعث تشنجات کلونیک اندام های جلویی شود و این نشان می دهد که فعالیت تشنجی لیمبیک بایستی از طریق ساختارهای حد واسط به ساختارهایی در مغز دسترسی پیدا کند که به مراکز حرکتی در مغز و نخاع مرتبط است(لوسچر و ابرت،1996). کیندلینگ پدیده ای است که در بسیاری از گونه های حیوانی از قورباغه تا بابون دیده شده است. نتایج مشابه نشان داد که این پدیده مخصوص به گونه خاصی نیست. تحقیقات بعدی پایداری روند کیندلینگ را نشان دادند. در این تحقیقات مشاهده شد موش هایی که به مدت 12هفته تحریک شده اند، بعد از هفته دوازدهم با تحریک توسط محرک آستانه ای، تشنج کامل را نشان می دهند. این مطالعات گروه زیادی از محققین را تشویق کرد تا به دنبال پایه و اساس بیوشیمی و الکتروفیزیولوژی این پدیده باشند. مزایای کیندلینگ نسبت به سایر مدل های آزمایشگاهی ایجاد صرع عبارتند از:(1) قابل مشاهده و ارزیابی بودن روند صرع- زایی مزمن؛ (2) قابل کنترل بودن الگوی گسترش و عمومی شدن تشنج و (3) قابل دستکاری بودن دوره های حمله ای، بین حمله ای و پس از حمله ای(موریموتو و همکاران،2004). احتمال داده می شود مکانیسم های ایجاد کیندلینگ مشابه مکانیسم های ایجاد تشنج در انسان باشد لذا از سال 1969 تاکنون در تحقیقات زیادی از این مدل استفاده شده است(لوسچر،1997). 2-2-1- انواع کیندلینگ کیندلینگ را بر اساس نوع محرک و نحوه تحریک مغز به سه نوع تقسیم بندی می کنند(نامارا و همکاران،1980). الف) کیندلینگ الکتریکی: مدلی است که با استفاده از محرک الکتریکی زیر آستانه ای، به صورت موضعی یکی از جایگاه های حساس مغز را به طور مکرر تحریک می کنند. ب) کیندلینگ متقارن: در این مدل با استفاده از محرک الکتریکی، جایگاه حساس را به صورت دو طرفه تحریک می کنند. ج) کیندلینگ شیمیایی: که در آن مواد شیمیایی تشنج زا از قبیل پنتیلن تترازول با دوزهایی که در ابتدا تشنج زا نیستند، به طور مکرر به حیوان تزریق می شود. برای کیندلینگ شیمیایی از داروهایی مثل لیدوکایین، بیکوکولین و همچنین اسیدهای آمینه تحریکی نیز استفاده می شود(تراینلیس و همکاران،1989؛ موریست و همکاران،1989). 2-2-2-کیندلینگ پنتیلن تترازول کیندلینگ شیمیایی القا شده توسط پنتیلن تترازول، یک مدل شناخته شده ازصرع مزمن است. دراین مدل تزریق مکرر دوز زیر تشنجی پنتیلن تترازول سبب گسترش تشنجات بادوام وتدریجی می شود(روکا و همکاران،1999). پنتیلن تترازول (PTZ)، همچنین به عنوان مترازول، پنتترازول، پنتامتیلن تترازول و کاردیازول شناخته شده است. پنتیلن تترازول آنتاگونیست غیر رقابتی گابا (گاما آمینو بوتیریک اسید) است . مکانیسم عمل صرع از پنتیلن تترازول در سطح سلولی نورون ها هنوز نامشخص است. مطالعات الکتروفیزیولوژیک نشان داده اند که با افزایش نفوذپذیری آکسون نسبت به پتاسیم باعث کاهش پتانسیل های عمل می شود و از سویی مطالعات دیگر نشان داده اند که با افزایش جریان سدیمی و کلسیمی منجر به افزایش کلی تحریک پذیری نورون ها می شود. دریافت فایل بررسی نقش گیرنده 5-HT1A بر تقویت پتانسیل های میدانی شکنج دندانه دار در مدل صرعی کیندلینگ موش صحرایی

جداسازی، تعیین هویت مولکولی وتهیه الگوی ژنومی مایکوباکتریوم های کمپلکس توبرکلوزیس ازگاوهای توبرکولین مثبت استان خراسان

جداسازی، تعیین هویت مولکولی وتهیه الگوی ژنومی مایکوباکتریوم های کمپلکس توبرکلوزیس ازگاوهای توبرکولین مثبت استان خراسان فهرست مطالب صفحه چکیده1 فصل اول (مقدمه و هدف) 3 1-1-بیماری سل5 1-2- مایکو باکتریوم ها 7 1-2-1-نامگذاری7 1-2-2- طبقه بندی مایکو باکتریوم ها ...................................................................................................................9 1_2_3_ مورفولوژی و خصوصیات میکروسکوپی ........................................................................................... 11 1-2-4- خصوصیات رشد مایکوباکتریها .............................................................................................................12 1-2-5- فاکتورهای ویورلانس مایکوباکتریوم ها..................................................................................................13 1-2-6- آنتی ژنهای مایکوباکتریوم ها..................................................................................................................14 1-3- پاتوژنز ........................................................................................................................................................15 1-4- اشکال بیماری سل .....................................................................................................................................17 1-5- عوامل مساعد کننده ....................................................................................................................................17 1-6- عارضه های بیماری.....................................................................................................................................18 1-7- پیدایش بیماری ...........................................................................................................................................18 1-8- روشهای تشخیص ......................................................................................................................................20 1-9- درمان .........................................................................................................................................................21 1-10- عوارض داروهای ضد سل ......................................................................................................................22 1-11- پیشگیری ..................................................................................................................................................22 1_11 _1_ پیشگیری در جامعه ...........................................................................................................................23 1_11_2_ پیشگیری با واکسن سل.......................................................................................................................23 1-12- اهمیت مبارزه صحیح با سل ....................................................................................................................23 1-13- سل گاوی.................................................................................................................................................24 1-13-1-بیماری سل در گاو ...............................................................................................................................24 1-13-2-علائم بالینی سل گاوی..........................................................................................................................26 1-13-3-تشخیص بیماری سل در گاو ...............................................................................................................27 1-13-4-کنترل بیماری سل ................................................................................................................................27 1_14_ راههای ابتلا به سل گاوی .......................................................................................................................29 1-15- تعیین هویت مایکوباکتریومها ..................................................................................................................30 1_15_1_تعیین هویت مایکوباکتریومها بر اساس خصوصیات فنوتیپیک ..........................................................30 1- 15 -2- تعیین هویت مایکوباکتریومها بر اساس خصوصیات ژنوتیپی..........................................................35 1-15-2-1-تشخیص بیماری .............................................................................................................................36 1-15-2-2- تعیین هویت مولکولی مایکوباکتری هاجهت تعیین گونه ..............................................................39 1-15-2-2-1-پروب های اسید نوکلئیک ...........................................................................................................39 1-15-2-2-2 ریبوتایپینگ ..................................................................................................................................39 1-15-2-2-3- روش هیبریدیزاسیونDNA – DNA .......................................................................................39 1-15-2-2-4-پروب های هیبریداسیون داخل ژنومی تجاری ...........................................................................40 1-15-3-ژنوم مایکوباکتریوم توبرکلوزیس کمپلکس ..........................................................................................40 1-16-تکنیک های ژنومی ...................................................................................................................................42 1 _16_1_تکنیک‌های ژنومی که اساس آنها PCR نمی‌باشد .............................................................................42 1_16_1_2_انگشت‌نگاری DNA به روش RFLP ........................................................................................43 1_16_2_1_اسپولیگوتایپینگ..............................................................................................................................50 1_16_1_2_5_استفاده از مخلوط پروب‌ها در RFLP................................................................................... 50 1_16_2_2_ VNTR ........................................................................................................................................51 فصل دوم (مروری بر تحقیقات انجام شده) ......................................................................................................55 2-1-تاریخچه بیماری سل ..................................................................................................................................56 2-2-وضعیت بیماری سل در جهان ....................................................................................................................58 2-3-تاریخچه سل گاوی در ایران ......................................................................................................................65 فصل سوم (مراحل روش تحقیق) .....................................................................................................................70 3-1-جمع آوری نمونه ها ...................................................................................................................................71 3-2-مواد و تجهیزات مورد نیاز...........................................................................................................................71 3_2_1_ مواد مصرفی..........................................................................................................................................71 3_2_2_تجهیزات مورد نیاز ................................................................................................................................73 3_2_2_2 _تجهیزات مورد نیاز برای استخراج DNA........................................................................................73 3_2_2_3_ تجهیزات برای PCR........................................................................................................................73 3_2_2_4_ تجهیزات برای هضم آنزیمی............................................................................................................74 3_2_2_5_ تجهیزات الکتروفورز DNA و ساترن بلاتینگ................................................................................74 3_2_2_6_ تجهیزات هیبریداسیون.....................................................................................................................74 3_2_2_7_ تجهیزات آشکار سازی.....................................................................................................................74 3_2_2_8_ تجهیزات مورد نیاز برای نانودراپ...................................................................................................74 موارد روش تحقیق ..............................................................................................................................................74 3_3_13_4_1_تهیه گسترش از نمونه و رنگ آمیزی.........................................................................................74 3_4_1_3_تفسیر نتایج گسترش..........................................................................................................................76 3_4_ 2_کشت نمونه ها......................................................................................................................................76 3_4_2_ 1_صلایه کردن نمونه ها ................................................................................................................76 3_4_2_2_ آلودگی زدایی و هموژنیزاسیون ..................................................................................................76 3_4_2_3_سانتریفیوژ و خنثی سازی PH................................................................................................... 78 3_4_2_4_ کشت در لوله های لونشتاین - جانسون حاوی گلیسیرین و پیرووات.....................................79 3_4_3_بررسی کشت لوله های لونشتاین – جانسون .................................................................................80 3_4_4_ رنگ آمیزی به روش فلئورو کروم .............................................................................................. 80 3_4_5_ انجام تست های بیوشیمیایی تعیین هویت .....................................................................................81 3_4_5_1_تست نیاسین ...............................................................................................................................82 3_4_5_2_ تست کاتالاز ............................................................................................................................ 82 3_4_ 6_کشت مجدد در لوله لونشتاین – جانسون........................................................................................82 3_4_7_استخراجDNA ................................................................................................................................83 3_4_7_1_آماده سازی مواد مصرفی برای استخراج DNA........................................................................ 83 3_4_7_2_ کنترل و جمع آوری سلولهای باکتری رشد یافته .......................................................................83 3_4_7_3_مراحل استخراج DNA ..............................................................................................................84 3_4_8_ارزیابی کیفیت و کمیتDNAاستخراج شده.....................................................................................86 3_4_8_1_ارزیابی کفیت DNA استخراج شده............................................................................................86 3_4_8_1_1_آماده سازی مواد مصرفی جهت ارزیابی کیفی DNA استخراج شده..................................86 بافر تریس-بورات-EDTA یک برابر.............................................................................................................86 بافر نمونه.........................................................................................................................................................86 ژل آگارز..........................................................................................................................................................86 3_4_8_2_ارزیابی کمیت DNA استخراج شده برای انجام PCR و RFLP............................................. 88 3_4_8_3_ PCR بر اساس پروتکل WHO............................................................................................... 90 3-4-8-3-1مراحل PCR روی نمونه های DNA استخراج شده.................................................................91 3-4-9- الکتروفورز محصولPCR.............................................................................................................. 92 RFLP ............................................................................................................................................................92 3_4_10_هضم DNA کروموزمی به وسیله آنزیم Pvu II......................................................................... 93 3_4_11_جداسازی قطعاتDNA به وسیله الکتروفورز................................................................................94 3_4_12_ ساترن بلاتینگ ..............................................................................................................................94 3_4_12_1_آماده سازی محلول های مورد نیاز ساترن بلاتینگ ..................................................................94 3_4_12_2_عمل آوری ژل قبل از بلاتینگ ..................................................................................................96 3_4_12_3_بلاتینگ به روش موئینه .............................................................................................................96 3_4_12_3_عمل آوری غشا بعد از بلاتینگ ................................................................................................97 3_4_13_تثبیت DNA برروی غشا ..............................................................................................................98 3_4_14_تهیه پروب های هیبریداسیون و مک هیبریداسیون .............................................................................98 3_4_14_1_پروب PGRS ................................................................................................................................99 3_4_14_2_به دست آوردن رقت مناسب برای پروبPGRS به روش مک هیبریداسیون.............................99 3_4_15_شناسایی .............................................................................................................................................100 3_4_16_دات بلاتینگ ......................................................................................................................................101 3_4_17_پری هیبریداسیون و هیبریداسیون با پروب نشان دار با دیگوکسیژنین ............................................102 3_4_17_1_مرحله پری هیبریداسیون ..............................................................................................................102 3-4-17-2- مرحله هیبیریداسیون .....................................................................................................................102 فصل چهارم(نتایج و بحث ) ............................................................................................................................104 نتایج و بحث ......................................................................................................................................................105 4-1- نمونه برداری ...........................................................................................................................................105 4-2- بررسی کشت لوله های لونشتاین– جانسون ............................................................................................105 4-3-آزمون وجود IS6110 ..............................................................................................................................106 4-3-1- نتایج واکنش PCR............................................................................................................................ 106 4-4- بررسی کمیت DNA استخراج شده برای هضم آنزیمی ((RFLP...........................................................107 4-5- بررسیDNA استخراج شده ....................................................................................................................108 4-6- نتایج هضم آنزیمی(RFLP)، بررسی الکتروفورز و تهیه عکس................................................................109 4-7- نتایج ساترن بلاتینگ ................................................................................................................................110 فصل پنجم(نتیجه گیری و پیشنهادات) .............................................................................................................114 پیشنهادات ..........................................................................................................................................................125 منابع....................................................................................................................................................................126 منابع فارسی.........................................................................................................................................................126 منابع انگلیسی......................................................................................................................................................127 فهرست جدول ها عنوان جدول صفحه جدول1-1نامگذاری مایکوباکتریوم ها ................................................................................................................... 8 جدول1-2:لیست جدید تستهای رایج شیمیائی برای تمایز گونههای مختلف کندرشد مایکوباکتریای ................ 33 جدول 1- 3: لیست جدید تستهای رایج شیمیائی برای تمایز گونههای مختلف سریع الرشد مایکوباکتریایی .................... 35 جدول 3-1: تعداد 65 نمونه عقدههای لنفاوی گاو ارسالی به موسسه سرم سازی رازی ...................................... 71 جدول 3-2: لیست مواد مصرفی ........................................................................................................................... 72 جدول 3_3 : مواد متشکله در محیط کشت لونشتاین- جانسون ........................................................................... 79 جدول 3-4: تستهای تعیین هویت مایکوباکتریومها ........................................................................................... 81 جدول 3-5: برنامه دما، زمان و چرخه ترموسایکلر ............................................................................................... 91 جدول 4-1- نمونههای مورد استفاده به همراه الگوهای مشاهده شده و مکان جغرافیائی نمونهها ................................ 113 فهرست شکل ها عنوان شکل صفحه تصویر1-1 : شیوع بیماری سل در سال 2010..................................................................................................... 6 تصویر1-2-مایکوباکتریوم ها و دیواره سلولی آنها .......................................................................................................... 11 تصویر1-3: عکسبرداری توسط میکروسکوپ الکترونی از مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ............................................................................................. 11 تصویر1-4: کلنی های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس روی محیط لونشتاین جانسون ......................................... 13 تصویر1-5- دیواره سلولی مایکوباکتریوم ها ................................................................................................... 14 تصویر 1-8-بیماریزایی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس .................................................................................... 16 تصویر1-9:عکس قفسه سینه بیماری که به سل مبتلاست توسط اشعه ایکس ................................................. 20 تصویر 1-10-داروهای مورد استفاده برای درمان بیماری سل ...................................................................... 21 تصویر 1-11- دام مبتلا به سل، ضایعه سلی در بافت ریه............................................................................... 24 تصویر 1-12- مسیر انتقال مایکوباکتریوم بویس ............................................................................................. 29 تصویر1-13:ژنوم مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ................................................................................................. 41 تصویر1-14:ژنوم مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ................................................................................................. 41 تصویر1-15:ژنوم کامل سویه H37Rv مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ................................................................. 42 تصویر1-16: مراحل اصلی برای تشخیص پلی مورفیسم در ژنوم مایکوباکتریوم بویس با استفاده از روش REA .......................... 46 تصویر1-17: مراحل اصلی برای تشخیص پلی مورفیسم در ژنوم مایکوباکتریوم بویس با استفاده از روش RFLP ........................ 46 تصویر1-18: قطعات IS6110 و لوکوس DR در ژنوم مایکوباکتریوم توبرکلوزیس H37RV ............................. 51 تصویر1-19 : لوکوس DR و یک توالی فاصله انداز را DVR میگویند ......................................................... 51 شکل 1-20 : حذف توالی های فاصله انداز، که ممکن است در یک یا چند توالی فاصله انداز باشد ............. 52 تصویر2-1: مومیایی یافت شده در کـشور مصر ................................................................................................. 57 تصویر 3-1: نمونهای از عقدههای لنفاوی ....................................................................................................... 71 تصویر 3-2 باسیل اسیدفست در روش رنگآمیزی سرد کینیون در لام تهیه شده از سوسپانسیون................... 75 تصویر 3-3: باسیل اسیدفست در روش رنگآمیزی سرد کینیون در لام تهیه شده از عقده لنفاوی ................. 76 تصویر 3-4: باسیل اسیدفست در رنگآمیزی فلوئوروکروم .............................................................................. 81 تصویر 3-5: لولههای تست نیاسین مثبت و منفی ............................................................................................ 82 تصویر 3-6- نمائی از لولههای کشت مجدد مایکوباکتریوم بویس ................................................................. 83 تصویر3-7: دستگاه نانودراپ .......................................................................................................................... 88 تصویر 3- 8: صفحه گزینه های برنامه های نانودراپ ................................................................................... 88 تصویر 3-9: نحوه شروع کار و تنظیم دستگاه با آب مقطر ............................................................................. 89 تصویر 3-10: نمودار طول موج DNA نمونه و محاسبات ضروری برای کارهای مولکولی ............................ 90 تصویر 3-11: مراحل اجرائی الکتروفورز DNA هضم شده، ساترن بلات، هیبریداسیون و آشکارسازی ....................... 92 تصویر 3-12: راهنمای ترتیب قرار گرفتن کاغذها، ژل، غشاء نیتروسلولزی و وزنه در روش موئینهای ............................ 97 تصویر 3-13: دات بلات PGRS و DR ............................................................................................................................... 102 تصویر4-1- لوله های لونشتاین– جانسون: کلنی های کرم رنگ با ظاهر گل کلمی ...................................... 106 تصویر4-2- الکتروفورزمحصول PCR برای سکانس 245 جفت بازی IS6110 ........................................... 107 تصویر(4_3): نمودار طول موج DNA نمونه ................................................................................................ 108 شکل (4-5):DNA های مناسب برای انجام RFLP ....................................................................................... 109 تصویر(4_6): قطعات DNA ، هضم شده بوسیله آنزیم محدود کننده Pvu II ............................................... 110 تصویر(4-7): RFLP با آنزیم Pvu II و هیبریداسیون با پروب PGRS .......................................................... 111 تصویر(4-8):RFLP با آنزیم Pvu II و هیبریداسیون با پروب DR ................................................................ 112 چکیده: بیماری سل گاوی ناشی از مایکوباکتریوم بویس دربسیاری از کشورها ازجمله ایران شیوع دارد برای کنترل وریشه کنی این بیماری، شناسایی منبع عفونت، مسیر انتقال وحیوانات ناقل الزامی است، که این امربا استفاده از تمایز بین سویه های مختلف مایکوباکتریوم بویس، توسط تکنیک های مولکولی ازجمله RFLP صورت می پذیرد. جهت بهینه سازی وتسریع برنامه ریشه کنی دراین تحقیق، تکنیک RFLP توسط آنزیم Pvu II با استفاه از پروب های PGRS و DR از نظر تنوع الگوی ژنومی وشناسایی بهتر سویه ها مورد مقایسه قرارگرفتند. در مطالعه حاضر طی سالهای 1388 تا 1390 از 65 نمونه ی مشکوک به سل استان خراسان ارسالی به آزمایشگاه رفرانس مایکوباکتریومهای بیماریزای دام موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، پس از کشت، تعداد 12مورد اسمیر مثبت شناسایی گردید که پس از استخراج DNA و ارزیابی آنها تعداد 8 جدایه مناسب RFLP توسط دوتکنیک فوق مورد بررسی قرارگرفتند. جدایه های مورد نظر بر روی محیط کشت لونشتاین جانسون پیرووات دار و گلیسرینه کشت داده شدند. کلیه جدایه ها به روش مولکولی و بیوشیمیایی تعیین هویت گردیدند. از کلنی های مشخص طبق روش ون- سولینگن ، DNA باکتریایی استخراج شد. سپس DNA های مایکوباکتریوم بویس جدایه گاوی توسط آنزیم محدود کننده Pvu II هضم و الگوهای بدست آمده با روش RFLP پس از هیبریداسیون با پروب های PGRS و DR با یکدیگر مقایسه شدند. در هیبرید سازی با PGRS از 8 سویه مورد مطالعه تعداد 2 الگوی مختلف و پس از هیبرید سازی با DR تعداد 3 الگوی مختلف به دست آمد. این تحقیق شواهد محکمی براین است که در گاوهای استان خراسان مایکوباکتریوم وجود دارد و احتمال انتقال به انسان و ایجاد بیماری سل حتمی است. لازم به ذکراست که تحقیق حاضر اولین مطالعه مولکولی برروی مایکوباکتریوم در گاوهای استان خراسان می باشد، لذا تعمیم برنامه های مبتنی برشناسایی مایکوباکتریومها در سایر استانها برای ردیابی عامل سل درگاوها و ارتباط آن با بیماری سل درانسان ضروری است. کلید واژه: مایکوباکتریوم توبرکلوزیس کمپلکس- تعیین هویت مولکولی – RFLP PGRSDR, فصل اول مقدمه و کلیات 1-مقدمه: سل یک بیماری واگیردار است. تقریبا یک سوم جمعیت جهان (یعنی 2 میلیارد نفر) به میکروب سل آلوده و در خطر ابتلا به بیماری قرار دارند و هر ساله حدود 9 میلیون نفر به سل فعال مبتلا شده و حدود 5/1 تا 2 میلیون نفر در اثر این بیماری جان می سپارند. شیوع مجدد بیماری در دو دهه اخیر نشان دهنده درگیر بودن تمام کشورها با مایکوباکتریوم‌ها بوده است. بیش از 90 درصد موارد بیماری و مرگ ناشی از سل در کشورهای در حال توسعه رخ می دهد. با جهانی شدن بیماری مهلک ایدزومساله حائز اهمیت مقاومت چند داروئی که نتیجه مدیریت ضعیف درمان سل است، سازمان بهداشت جهانی(WHO) درمجمع سال 1991 ضمن اعلام بیماری سل به عنوان یک اورژانس جهانی، کاهش هر چه سریع تر میزان شیوع مرگ و میر و به تبع آن میزان بروز سل را در اهداف کلی خود و کشورها قرار داده و سپس با معرفی راهبرد DOTS زمینه کنترل بیماری را بطور نسبی فراهم آورد. در حال حاضر با توجه به دادههای آماری سل یکی از بزرگترین علت مرگ ناشی از بیماریهای عفونی تک عاملی بوده(حتی بیش از ایدز، مالاریا و سرخک) و دارای مرتبه دهم در بار جهانی بیماری هاست و پیش بینی می شود تا سال 2020 همچنان جایگاه کنونی را حفظ کند و یا تا مرتبه هفتم بالا رود. (هاین و کریمر، 2012). باسیل این بیماری مایکوباکتریوم توبرکلوزیس یا باسیل کخ نام دارد زیرا که در سال ۱۸۸۲ (میلادی) پرفسور رابرت کخ دانشمند آلمانی آن را کشف کرد. بیماری سل گاوی یکی از قدیمی ترین بیماریهای عفونی مشترک بین انسان و دام است که قدمت آنرا به اندازه حیات بشریت می‌دانند و از گذشته‌های دور مورد شناسایی قرار گرفته است. (سینگ و ورما، 2004). سل گاوی که عامل آن مایکوباکتریوم بویس میباشد، یکی از اعضای گروه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس کمپلکس است. این بیماری یکی از مهمترین بیماریهای عفونی خانواده بویده به ویژه گاوها و خانواده کاپرینه به ویژه بزها در سراسر دنیا از جمله ایران میباشد و سالیانه رقم قابل توجهی را برای پیگیری و ادامه برنامه ریشه‌کنی به خود اختصاص میدهد. در ایران علیرغم به کارگیری برنامه ریشه کنی سل گاوی با این که شیوع این بیماری در گاوداریهای صنعتی بشدت کاهش پیدا کرده است ولی هنوز سل گاوی در دامداری های کشور دیده می‌شود به همین منظور برای کنترل بیماری سل گاوی برنامه های ریشه کنی و کنترل از سال 1334 مورد اجرا درآمده و نتایج نشان میدهد که از17 % به 14/0% کاهش یافته است. علوی (1388) برنامه های تست و کشتار دام های آلوده، ‌مسیر نقل و انتقال دام ها و شناسایی منبع عفونت و تکنیک های مولکولی و بیوشیمیایی توانسته اند با شناسایی سویه های مایکوباکتریومها از پیشرفت و شیوع ْآن جلوگیری نمایند. داوید و همکاران (1987) شناسایی سریع عفونت در گله های گاوهای کشور برای جلوگیری از انتقال یک امر ضروری میباشد زیرا مایکوباکتری های پاتوژن دارای دوره انکوباسیون طولانی مدت بوده و این امر تشخیص آزمایشگاهی آن را با مشکل مواجه می‌سازد. امروزه از مطالعات اپیدمیولوژی سل در ارزیابی برنامه های کنترل بیماری، تعیین بروز و میزان شیوع و از ژنوتایپینگ ایزوله ها و مولکولار اپیدمیولوژی در قرابت و طبقه بندی سویه ها، ارتباط بین سل حیوانات مختلف و سایر فاکتور های دخیل در آن و همچنین ردیابی منشاء عفونت استفاده های شایانی می‌نمایند. لذا بکارگیری روش های نوین جهت تشخیص این بیماری بسیار ضروری میباشد. امروزه تکنیک های مولکولی مانند انگشت نگاری ژنومی به روش RFLP، برای شناسایی دقیق و متمایز نمودن ایزوله های مایکوباکتریوم میباشد. داوید و همکاران(1987) پروب ها قطعه ای از ملکول های تک رشته ای RNAیا DNA هستند که به روشهای مختلف نشان دار یا لیبل میشوند. این پروب ها با توالی نوکلئوتیدی مکمل خود با DNAی هدف، در شرایط ویژه آزمایشگاهی هیبرید می‌شوند. سپس نواحی هیبرید شده به طرق مختلف ردیابی شده تا تفاوت سویه ها به لحاظ جایگزینی پروب در نواحی خاص کروموزم نمایان گردند. پریراز و همکاران(2012) در این مطالعه سعی شده است جدایه‌های بدست آمده باتکنیک RFLP با آنزیم PvuIIو استفاده از پروب‌های PGRS و DR از نظر تنوع الگوی ژنومی مورد مقایسه قرار گیرند. اهدف تحقیق: از آنجائیکه در بحث کنترل منطقه ای سل و ردیابی منشاء عفونت این بیماری، به قدرت تفکیک گونه ها و سویه‌های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس کمپلکسنیاز میباشد، تحقیقات اپیدمیولوژی مولکولی شکل جدیدی را به خودگرفته است. در همین راستا و در امر کنترل و ریشه کنی بیماری سل گاوی شناسایی منابع عفونت، مسیرهای انتقال و پیدا نمودن مخازن از چالش های اصلی است و تمایز سویه های مختلف مایکوباکتریوم توبرکلوزیس کمپلکس در تمامی استان‌های کشور الزامی به نظر میرسد.تکنیک‌های جدید مولکولی، برای متمایز نمودن سویههای مایکوباکتریوم توبرکلوزیس جدا شده از منابع مختلف و جهت بررسی‌های اپیدمیولوژی ابزارهائی کارا به شمار می آیند(می هی و همکاران، 2011). با وجود انجام مطالعات متعدد در مناطق مختلف ایران در ارتباط با مولکولار اپیدمیولوژی این بیماری اطلاعات چندانی در این زمینه در استان خراسان در اختیار نبوده و بررسی شیوع مجدد بیماری سل و ارزیابی ریشه های انتقال در این استان از اهمیت ویژه ای برخوردار است. به همین منظور در این تحقیق سعی بر این است که با استفاده از تکنیک‌های تایپینگ مولکولی(انگشت نگاری ژنومی مایکوباکتریوم ها) مانند RFLP(پلی مورفیسم قطعات به وسیله آنزیم های محدودکننده) و با بهره گیری از متمایز کننده ترین روش های توصیه شده در تحقیقات گذشته، تمایز بین سویه های کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس جدا شده از گاوهایتوبرکولین مثبت استان خراسان صورت پذیرد تابتوان از یافته‌های تحقیق در اهداف فوق بهره جست. در مطالعه حاضر دو هدف دنبال میگردد: استفاده از تکنیک های براساس PCR همچون IS6110 در جهت تعیین هویت جدایه های کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس استفاده از تکنیک DR-PGRS – RFLP در جهت بررسی ژنتیک جمعیتی جدایه های مورد مطالعه و تعیین ژنوتیپ های موجود در استان خراسان 1-1-بیماری سل: مرض سل یا توبرکلوز (TB) یکی از بیماریهای مهلک در جهان است که عامل آن مایکوباکتریوم‌ها یا به طور دقیقتر مایکوباکتریومهای سلی است. در بیماری سل معمولا ششها مورد حمله قرار می‌گیرد، این نوع سل را تی بی ریوی نیز گویند ولی از سایر اعضای درگیر در سل می‌توان سیستم عصبی مرکزی، غدد لنفاوی و گردش خون، دستگاه تناسلی وادراری، دستگاه گوارش و معده، استخوان‌ها و مفاصل و پوست رانام برد. سایر مایکوباکتریومها مانند بووی، افریکنم، میکرتی و کانتی نیز باعث بیماری می‌شوند ولی نادر هستند. از انواع نشانه‌های سل می‌توان به سرفه مزمن همراه با خلط سینه اغشته به خون، تب، تعریق شبانگاهی و کاهش وزن اشاره کرد. سل را می‌توان با رادیوگرافی قفسه سینه، تست پوست و خون و بررسی میکروسکوبی وکشت میکروبی خلط و مایعات بدن درازمایشگاه تشخیص داد. درمان سل مشکل است وبه دوره‌های طولانی و استفاده از انتی بیوتیک‌های متفاوت نیاز دارد همچنین باید رفتار وتماس افراد کنترل شود. گونه های مقاوم به آنتی بیوتیک مایکوباکتریوم در سالهای اخیر درمان سل را با مشکل روبه رو کرده است. تصویر1-1 : شیوع بیماری سل در سال 2010در هر 100000نفر. قهوه ای بیشتر از 300، بنفش=299-100، خردلی=99-50 ،نارنجی=49-25،زرد 24-1 و خاکستری صفر پیشگیری از الوده شدن به سل وکنترل تماسهای افراد وهمچنین واکسیناسیون توسط واکسن ب ث ژ بهترین شیوه مبارزه با سل است. باکتری‌های سل می‌توانند توسط عطسه وسرفه ویا تف کردن افراد آلوده به سل در محیط پخش شوند. در حال حاضر حدود یک سوم جمعیت جهان به باکتری‌های سل نوع ضعیف آلوده‌اند وسرعت آلوده شدن افراد درحال حاضر یک نفر در هر ثانیه‌است هرچند بسیاری از این عفونت‌ها به صورت نهانی هستند. حدود یک دهم این عفونت‌ها نهایتا به سل آشکار تبدیل می‌شوند واگر بدون معالجه رها شوند بیش از نیمی از آنها به مرگ منجر می‌شود. عزیزی، فریدون (1379) در سال ۲۰۰۴ حدود 14.6 ملیون نفردر جهان از بیماری نوع شدید سل رنج می‌برند وحدود 8.9 ملیون نفردر جهان مستعد نوع شدید سل هستند وحدود1.6 ملیون نفر نیز بر اثر سل مردند. بیشتر این آمار مربوط به کشورهای جهان سوم است اما این آمار حتی در کشورهای پیشرفته نیز رشد داشته دلیل این امر می‌تواند کم کاری در زمینه واکسیناسیون و یا گسترش بیماری ایدز ‌باشد. حدود ۸۰٪ افراد سلی در آسیا و آفریقا هستند ودرآمریکا حدود ۵ تا ۱۰ درصد به آزمایش سل جواب مثبت داده‌اند. در آمریکا۲۵۰۰۰ نفر مستعد سل وجود دارد وحدود ۴۰٪ سل در آمریکا به دلیل مهاجرت افراد آسیایی و آفریقایی رخ می‌دهد. با شروع عملیات ریشه کنی سل گاوی در ایران از سال 1337 به تدریج موارد سل گاوی کاهش یافته به طوریکه با استفاده از تست توبرکولین و کشتار گاوهای آلوده، آلودگی سل گاوی در کشور ازحدود 5% در سال1351 به 12/0 در صد در سال 1383 رسید. بدین ترتیب با کنترل بهداشتی دامداری‌ها و کشتارگاه‌ها موارد سل گاوی کاهش یافت و با پاستوریزاسیون و جوشاندن شیر، بیماری ناشی از سل گاوی در انسان به تدریج رو به نقصان گذاشت. 1-2-مایکوباکتریوم ها: مایکوباکتریومها، ارگانیسم های میله ای شکل، نازک وبدون تحرک متعلق به خانواده مایکوباکتریاسهورده اکتینومیستالها وکلاس اکتینومیسه میباشند. موًید و همکاران (2012) نام مایکوباکتریوم به معنی باکتری قارچی است که به خصوصیت قارچ مانند باسیل سل اشاره دارد. لمیشنکو و همکاران(2008) در حال حاضر تا ژانویه سال 2010 تعداد 158 گونه مختلف در جنس مایکوباکتریوم شناسایی شده است. آسیمو و مد(2008) این گونه ها طیف وسیعی ازعفونتهای موضعی تا بیماریهای منتشر را در انسان و حیوانات ایجاد میکنند. اگرچه بعضی از گونه ها فقط درانسان عفونت ایجاد می کنند ولی سایرگونه ها ازحیوانات گوناگونی جدا شده است. همچنین گونه های زیادی درآب وخاک یافت میشوند. از بسیاری جهات، مایکوباکتریومها را براساس تفاوتهای بنیادی دراپیدمیولوژی وبیماری، به دوگروه اصلی زیرتقسیم می شوند.: 1-کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس شامل (مایکوباکتریوم توبرکلوزیس، مایکوباکتریوم آفریکانوم، مایکوباکتریوم بویس BCG، مایکوباکتریوم بویس، مایکوباکتریوم پینیپدی، مایکوباکتریوم کاپره، مایکوباکتریوم میکروتی، مایکوباکتریوم کانتی) که کند رشد وکلنی آنها فاقد پیگمان می باشند. 2- مایکوباکتریومهای غیرتوبرکلوزیس(NTM) 1-2-1-نامگذاری جنس مایکوباکتریوم یکی ازقدیمیترین جنسهایی است که مورد تعریف قرارگرفته است. نام ژنریک مایکوباکتریوم برای اولین بار به گروهی از ارگانیسم ها که برروی محیط های مایع به صورت لایه ای نازک شبیه کپک میروئیدند، اطلاق میگردید. لمیشنکو و همکاران (2008) درشروع قرن اخیرخصوصیاتی را که برای مایکوباکتریهاتعریف میکردند شامل نداشتن حرکت، مورفولوژی باسیلی شکل کمی خمیده ومیله ای شکل وخصوصیت مقاومت به اسید و الکل متعاقب رنگ آمیزی با فوشین فنی که (رنگ آمیزی ذیل نلسون) بود. راستوجی و همکاران (2001) در راسته اکتینومایستالز، مایکوباکتریوم متعلق به جنس مایکوباکتریوم بوده که تنها جنس خانواده مایکوباکتریاسه میباشد. مایکوباکتریاها، به عنوان اکتینومیستهای هوازی، مقاوم دربرابراسید والکل، میله ای شکل وگاهاً با توانائی ایجاد شاخه بدون ایجاد هیفه هوائی، تعریف میشوند. این باکتریها غیرمتحرک وبدون هاگ بوده و دردیواره سلولی دارای آرابینوز، گالاکتوز و مزودی آمینو پیمیلیک می باشند و نسبت درصد بازهای گوانین و سیتوزین، دراسید هسته ای شان(DNA) درحدود 62 تا 70 مول درصد می باشد(بجزمایکوباکتریوم لپره که درصد بازهای GC آن 58 %است). مایکولیک اسیدشان دارای وزن مولکولی بالا(60تا90کربن) بدون ترکیبات با بیش از دو پیوند دوگانه غیراشباع می باشد(گوترزو همکاران، 1995). از قدیم این ارگانیسم ها را فاقد کپسول قلمداد میکردند لیکن درحال حاضر مایکوباکتریها را همراه با ساختمان کپسولی شکلی می شناسند(96). این ارگانیسم ها را به طور اولیه به عنوان هوازی های اجباری قلمداد مینمودند، ولی برخی از گونه ها وسویه ها، میکروائروفیلیک بوده و به صورت نوارباریکی در زیر سطح محیط های نیمه جامد رشد می نمایند. اکتینومیست ها از نقطه نظر خصوصیات اکولوژیکی ومورفولوژیکی شامل میکروارگانیسم های متفاوتی می باشند. دور و همکاران (2000) تمامی مایکوباکتریها و میکروارگانیسم های وابسته مثل اعضای (کورینه باکتریوم، مایکوباکتریوم ونوکاردیا و گروهی که شامل جنس های رودوکوکوس، گوردونه و تسوکامورلا می باشد) براساس توانائی تولید مایکولیک اسید دارای وزن مولکولی بالای اسید چربβ هیدروکسی با زنجیره بلند جانبیα متمایز می شوند. دور و همکاران (2000) اعضای گروه کورینه باکتریوم، مایکوباکتریوم و نوکاردیا[CMN] تنها میکرارگانیسم هایی هستند که قادر به سنتز مایکولیک اسیدمی باشند. دور و همکاران (2000) جدول1-1نامگذاری مایکوباکتریوم ها 1-2-2-طبقه بندی مایکوباکتریوم ها: در گذشته نامگذاری عفونتهای مایکوباکتریایی، بدون در نظر گرفتن نوع ارگانیسم به مایکوباکتریهای سلی و مایکوباکتریهای غیرسلی(همچنین عبارت مایکوباکتری های آتیپیک یا مایکوباکتری های مجزا از گروه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس کمپلکس) محدود می‌شد. اولین تقسیم‌بندی شامل مایکوباکتریوم توبرکلوزیس عامل سل انسانی، مایکوباکتریوم بویس مسئول سل گاوی، مایکوباکتریوم آفریکانوم مسبب سل انسان و اساسا محدود به آفریقا، مایکوباکتریوم میکروتی پاتوژن جوندگان کوچک و سویه واکسینال مایکوباکتریوم ب.ث.ژ. بود. با ظهور تکنولوژی تعیین توالی اسیدهای نوکلئیک و ژنوتایپینگ این امکان به وجود آمده است که ارتباط بهتری در توصیف مجدد ژنوتایپینگ وفنوتایپینگ موجود، فراهم شود. این موضوع در تشخیص گونه های جدید هم موثر بوده است. نامگذاری باکتریها به وسیله کد بین المللی صورت گرفته ونام صحیح مربوط به طبقه باکتری بر اساس درج باکتری در منابع معتبر علمی که دارای نشر طولانی و اعتبار قانونی در مجامع علمی هستند صورت میگیرد. از اوایل ژانویه1980 نام باکتری های قبلی بر اساس لیست تائید شده نامگذاری باکتری انجام گرفت وهر باکتری که نام آن در لیست موجود نبود در نامگذاری قرار نمی گرفت. براساس علائم کلینیکی مهم، مایکوباکتریوم ها به3 گروه اصلی طبقه بندی میشوند: شدیداً پاتوژن، ازجمله پاتوژنهای انسانی شامل مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و مایکوباکتریوم لپره و پاتوژنهای حیوانی شامل مایکوباکتریوم بویس، که قادرند به بافت های طبیعی حمله و بیماری فعال و پیشرونده ایجاد کنند. پاتوژنهای فرصت طلب یا) پاتوژنهای بالقوه ( شامل مایکوباکتریوم سیمیه،مایکوباکتریوم آویوم ومایکوباکتریوم گزنوپی که به طور طبیعی و آزادانه در محیط زندگی می کنند و بصورت فرصت طلب باعث بیماری در انسان و حیوانات می شوند. ندرتاً پاتوژن شامل ساپروفیت هایی مانند مایکوباکتریوم فله ایو مایکوباکتریوم اسم گماتیسدر میان مایکوباکتریوم ها عبارت (MAIS)قبلا به گروهی از مایکوباکتریوم های کند رشد که شامل کمپلکس مایکوباکتریوم آویوم، مایکوباکتریوم اینتراسلولار، مایکوباکتریوم اسکوروفولاسئوممی باشد، اطلاق می شد که از نظر خصوصیات ظاهری به هم شبیه و در برخی مواقع تفریق آنها از یکدیگر مشکل بود. راستوجی (1992) امروزه واژه MAIS کاربرد چندانی ندارد به طوری که با استفاده از تکنیک هائی مانند هیبریدیزاسیون اسید هسته ای، آنالیز آنتی ژنی وتوانایی ارگانیسم در هیدرولیز اوره، مایکوباکتریوم اسکوروفولاسئوم به راحتی از مایکوباکتریوم آویوم و مایکوباکتریوم اینتراسلولار قابل تفکیک است. واژه دیگری که بسیار کاربرد دارد، کمپلکس مایکوباکتریوم آویوم(MAC) است که در برگیرنده دوگونه مایکوباکتریوم آویوم و مایکوباکتریوم اینتراسلولار می باشد که قبلا از سه تحت گونه مجزا به نامهای مایکوباکتریوم آویوم تحت گونه آویوم، مایکوباکتریوم آویوم تحت گونه پاراتوبرکلوزیس و مایکوباکتریوم آویوم تحت گونه سیلواتیکم تشکیل می شد( آرونی تانگ وان و همکاران، 2010). دریافت فایل جداسازی، تعیین هویت مولکولی وتهیه الگوی ژنومی مایکوباکتریوم های کمپلکس توبرکلوزیس ازگاوهای توبرکولین مثبت استان خراسان