ایرانی فایل

فروش فایل های قابل دانلود

ایرانی فایل

فروش فایل های قابل دانلود

تحقیق پاورپوینت واکنش ها و معادلات شیمیایی

تحقیق پاورپوینت واکنش ها و معادلات شیمیایی

تحقیق پاورپوینت واکنش ها و معادلات شیمیایی

لینک دانلود و خرید پایین توضیحات
دسته بندی : PowerPoint
نوع فایل : .ppt ( قابل ویرایش و آماده پرینت )
تعداد اسلاید :
11 اسلاید

 

شواهد واکنش های شیمیایی

قسمت A

واکنش اول :نوار منیزیم خاکستر مانند است

واکنش دوم :تست تورنسل حالت اسیدی یا بازی را

نشان می دهد

قسمت B

واکنش اول: جامد تبدیل به مواد سفید رنگ میشود وبخار از لوله بیرون می آید.

واکنش دوم: جامد دوباره به رنگ آبی در می آید





بررسی تاثیر محلولپاشی نانوکلات پتاسیم بر خصوصیات فیزیولوژیکی و مورفولوژیکی برگ توتون رقم کوکر 347

بررسی تاثیر محلولپاشی نانوکلات پتاسیم بر خصوصیات فیزیولوژیکی و مورفولوژیکی برگ توتون رقم کوکر 347

بررسی تاثیر محلولپاشی نانوکلات پتاسیم بر خصوصیات فیزیولوژیکی و مورفولوژیکی برگ توتون رقم کوکر 347

فهرست مطالب
فصل اول
1-1 مقدمه 2
1-1 تعریف تکنولوژی نانو 2
1-1-1 تاریخچه نانو تکنولوژی 2
1-1-2 کاربرد تکنولوژی نانو در تولید کودهای کشاورزی 2
1-1-3 فواید و معایب نانو تکنولوژی 3
اهمیت گیاه توتون 3
1-2-1تاریخچه توتون 4
1-2-2 مناطق تولید توتون در جهان 4
1-2-3 مناطق مستعد کشت توتون در ایران 5
مشخصات گیاهشناسی توتون 5
نیازهای اقلیمی 6
1-3 نقش پتاسیم در گیاه 6
1-3-1 کمبود پتاسیم در گیاه 7
1-4 تنشهای گیاهی 7
تعریف تنش 8
1-4-1-1 تنش آب 8
1-5 تاثیر تنش خشکی بر میزان جذب پتاسیم در گیاه 11
1-6 اثرات فیزیولوژیکی تنش خشکی در گیاهان 11
1-7 پاسخ روزنه به تنش خشکی 12
1-7-1 نقش پتاسیم در پاسخ روزنه 13
1-8 اثرات تنش خشکی بر فتوسنتز 13
1-8-1 نقش پتاسیم در فتوسنتز 13
1-9 روشهای مقابله گیاه با تنش 13
1-10 کلروفیلها 14
1-10-1 طیف جذبی کلروفیلها 14
1-11 کاروتنوئیدها 15
1-12 ترکیبات فنلی 16
1-13 پرولین 17
1-14 مرور منابع 18
1-14-1 تاثیر تنش خشکی بر محتوای پرولین 18
1-14-2 تاثیر تنش خشکی بر محتوای پروتئین 19
1-14-3 تاثیر تنش خشکی بر محتوای رنگیزههای فتوسنتزی 19
1-14-4 بررسی اثر تنش خشکی بر محتوای MDA 20
1-14-5 بررسی اثر تنش خشکی بر محتوای فنول تام 20
1-14-6 بررسی اثر تنش خشکی بر محتوای پتاسیم برگ 21
1-14-7 نحوه عملکرد نانو مواد در تنش خشکی 21
1-15 اهداف پژوهش 23
فصل دوم
2- مواد و روشها 24
2-1- تجهیزات و مواد شیمیایی 25
2-1-1 مواد شیمیایی 25
2-1-2 تجهیزات 25
2-1-3 ابزار و لوازم مصرفی 26
2-2 مشخصات نمونه گیاهی 26
آماده سازی اتاق کشت 26
2-4 آبیاری 27
2-5 آمادهسازی گلدانها 27
2-5-1 تهیهی محلول هوگلند 27
اعمال تنش خشکی 30
تیماردهی 30
نمونهبرداری 30
2-9 سنجش پرولین 30
2-10 سنجش پروتئین کل به روش برادفورد 31
2-10-1 تهیة معرف برادفورد 31
2-10-2 ترسیم منحنی استاندارد 32
2-11 سنجش کلروفیل و کاروتنوئید 32
2-12 اندازهگیری مالون دی آلدهید 33
2-13 استخراج آنتی اکسیدانهای غیرآنزیمی 33
2-13-1 سنجش آنتی اکسیدانهای غیرآنزیمی 34
2-13-1-1 سنجش فنل تام 34
2-13-1-2 رسم منحنی استاندارد گالیک اسید 34
2-14 اندازه گیری پتاسیم به روش نشر شعله (AES) 35
2-14-1 تهیه عصاره گیاه به روش سوزاندن خشک و ترکیب باHCL 35
2-14-2 تهیه محلول ها 36
2-14-3 روش کار 36
2-15 تجزیه آماری 37
فصل سوم
3- نتایج 38
3-1 اندازهگیری مقادیر پرولین 39
3-1-1 نتایج حاصل از سنجش پرولین در چین اول 39
3-1-2 نتایج حاصل از سنجش پرولین در چین دوم 40
3-1-3 نتایج حاصل از سنجش پرولین در چین سوم 40
3-2 اندازهگیری مقادیر پروتئین 42
3-2-1 نتایج حاصل از سنجش پروتئین در چین اول 42
3-2-2 نتایج حاصل از سنجش پروتئین در چین دوم 43
3-2-3 نتایج حاصل از سنجش پروتئین در چین سوم 44
3-3 رنگیزههای فتوسنتزی 46
3-3-1 کلروفیل a 46
3-3-1-1 نتایج حاصل از سنجش کلروفیل a در چین اول 46
3-3-1-2 نتایج حاصل از سنجش کلروفیل a در چین دوم 47
3-3-1-3 نتایج حاصل از سنجش کلروفیل a در چین سوم 48
3-3-2 کلروفیل b 49
3-3-2-1 نتایج حاصل از سنجش کلروفیل b در چین اول 49
3-3-2-2 نتایج حاصل از سنجش کلروفیل b در چین دوم 50
3-3-2-3 نتایج حاصل از سنجش کلروفیل b در چین سوم 51
3-3-3 کلروفیل کل 53
3-3-3-1 نتایج حاصل از سنجش کلروفیل کل در چین اول 53
3-3-3-2 نتایج حاصل از سنجش کلروفیل کل در چین دوم 53
3-3-3-3 نتایج حاصل از سنجش کلروفیل کل در چین سوم 54
3-3-4 کاروتنوئید 55
3-3-4-1 نتایج حاصل از سنجش کاروتنوئید در چین اول 55
3-3-4-2 نتایج حاصل از سنجش کاروتنوئید در چین دوم 56
3-3-4-3 نتایج حاصل از سنجش کاروتنوئید در چین سوم 57
3-4 اندازهگیری پراکسیداسیون لیپیدی 58
3-4-1 نتایج حاصل از سنجش پراکسیداسیون لیپیدی در چین اول 58
3-4-2 نتایج حاصل از سنجش پراکسیداسیون لیپیدی در چین دوم 59
3-4-3 نتایج حاصل از سنجش پراکسیداسیون لیپیدی در چین سوم 60
3-5 اندازه گیری غلظت فنل 62
3-5-1 نتایج حاصل از اندازهگیری فنل تام در چین اول 62
3-5-2 نتایج حاصل از اندازهگیری فنل تام در چین دوم 63
3-5-3 نتایج حاصل از اندازهگیری فنل تام در چین سوم 64
3-6 اندازهگیری مقادیر پتاسیم برگ 65
3-6-1 نتایج حاصل از مقادیر پتاسیم برگ با استفاده از روش نشر شعله در چین اول 65
3-6-2 نتایج حاصل از مقادیر پتاسیم برگ با استفاده از روش نشر شعله در چین دوم 66
3-6-3 نتایج حاصل از مقادیر پتاسیم برگ با استفاده از روش نشر شعله در چین سوم 67
فصل چهارم
4- بحث و نتیجهگیری 69
4-1 اثرات تنش خشکی بر اندازهگیری پرولین 70
4-2 اثرات تنش خشکی بر اندازهگیری پروتئین 71
4-3 اثرات تنش خشکی بر اندازهگیری رنگیزههای فتوسنتزی 71
4-4 تاثیر تنش بر پراکسیداسیون لیپیدی 72
4-5 تاثیر تنش بر فنول تام 74
4-6 تاثیر تنش بر مقدار پتاسیم برگ 74
4-7 نتیجهگیری 75
4-8 پیشنهادات 76
منابع 77
فهرست اشکال
2-1 نمایی از اتاقک کشت 26
شکل 2-2 رشد گیاه در اتاق کشت 30
شکل 3-1 تغییرات مقادیر پرولین در چین اول 39
شکل 3-2 تغییرات مقادیر پرولین در چین دوم 40
شکل 3-3 تغییرات مقادیر پرولین در چین سوم 40
شکل 3-4 میانگین تغییرات مقادیر پرولین در چین اول، دوم و سوم 42
شکل 3-5 تغییرات مقادیر پروتئین در چین اول 43
شکل 3-6 تغییرات مقادیر پروتئین در چین دوم 44
شکل 3-7 تغییرات مقادیر پروتئین در چین سوم 45
شکل 3-8 میانگین تغییرات مقادیر پروتئین در چین اول، دوم و سوم 46
شکل 3-9 تغییرات مقادیر کلروفیل a در چین اول 47
شکل 3-10 تغییرات مقادیر کلروفیل a در چین دوم 47
شکل 3-11 تغییرات مقادیر کلروفیل a در چین سوم 48
شکل 3-12میانگین تغییرات مقادیر کلروفیل a در چین اول، دوم و سوم 49
شکل 3-13 تغییرات مقادیر کلروفیل b در چین اول 50
شکل 3-14 تغییرات مقادیر کلروفیل b در چین دوم 51
شکل 3-15 تغییرات مقادیر کلروفیل b در چین سوم 52
شکل 3-16 میانگین تغییرات مقادیر کلروفیل b در چین اول، دوم و سوم 52
شکل 3-17 تغییرات مقادیر کلروفیل کل در چین اول 53
شکل 3-18 تغییرات مقادیر کلروفیل کل در چین دوم 54
شکل 3-19 تغییرات مقادیر کلروفیل کل در چین سوم 54
شکل 3-20 میانگین تغییرات مقادیر کلروفیل کل در چین اول، دوم و سوم 55
شکل 3-21 تغییرات مقادیر کاروتنوئید در چین اول 56
شکل 3-22 تغییرات مقادیر کاروتنوئید در چین دوم 56
شکل 3-23 تغییرات مقادیر کاروتنوئید در چین سوم 57
شکل 3-24 میانگین تغییرات مقادیر کاروتنوئید در چین اول، دوم و سوم 58
شکل 3-25 تغییرات مقادیر مالون دی آلدهید در چین اول 59
شکل 3-26 تغییرات مقادیر مالون دی آلدهید در چین دوم 60
شکل 3-27 تغییرات مقادیر مالون دی آلدهید در چین سوم 61
شکل 3-28 میانگین تغییرات مقادیر مالون دی آلدهید در چین اول، دوم و سوم 62
شکل 3-29 تغییرات مقادیر فنل تام در چین اول 63
شکل 3-30 تغییرات مقادیر فنل تام در چین دوم 63
شکل 3-31 تغییرات مقادیر فنل تام در چین سوم 64
شکل 3-32 میانگین تغییرات مقادیر فنل تام در چین اول، دوم و سوم 65
شکل 3-33 تغییرات مقادیر پتاسیم در چین اول 66
شکل 3-34 تغییرات مقادیر پتاسیم در چین دوم 66
شکل 3-35 تغییرات مقادیر پتاسیم در چین سوم 67
شکل 3-36 میانگین تغییرات مقادیر پتاسیم در چین اول، دوم و سوم 68
فهرست جداول
2-1 (الف) غلظت عناصر غذایی پرمصرف در محلول هوگلند 27
2-1 (ب) غلظت عناصر غذایی کم مصرف در محلول هوگلند 28
2-2 (الف) حجم محلول استوک عناصر غذایی پرمصرف در محلول هوگلند 28
2-2 (ب) حجم محلول استوک عناصر غذایی کم مصرف در محلول هوگلند 29
2-4 غلظت گالیک اسید 34
چکیده
بررسی تاثیر محلولپاشی نانوکلات پتاسیم بر خصوصیات فیزیولوژیکی و مورفولوژیکی برگ توتون رقم کوکر 347
سمرقند واله
فناوری نانو بهعنوان علم کار کردن با کوچکترین ذرات، فناوری نوینی است که طی دهههای اخیر سبب بهبود سیستمهای کشاورزی شده است. استفاده از کودهای نانوکلاته بهجای کودهای مرسوم باعث میشود عناصر غذایی کود بهتدریج و بهصورت کنترل شده در تمام طول فصل رشد گیاه در خاک آزاد شوند. فرآوردههای نانو شامل مخلوطی از ذرههایی با ابعاد بین 1 تا 100 نانومتر هستند در نتیجه با کاهش نسبت سطح به حجم میتوانند خصوصیات فیزیکی و شیمیایی مواد اولیه خود را تغییر دهند و عملکرد سریعتری نسبت به فرآوردههای غیر نانو داشته باشند. تنش خشکی یکی از تنشهایی است که کاهش عملکرد را در مزارع توتون موجب میشود. کودهای پتاسیمدار نقش مهمی در ارتقای کیفیت توتون دارند. با توجه به نقشهای مهمی که عنصر پتاسیم در گیاهان بر عهده دارد، در شرایط تنش خشکی میزان بالای این عنصر در گیاه اثرات منفی ناشی از تنش را کاهش میدهد. در این تحقیق تنش خشکی توسط پلی اتیلن گلیکول با غلظت 20% اعمال شد. 48 ساعت پس از اعمال تنش، تیمار توسط نانو کلات پتاسیم در سه غلظت، طی 9 روز انجام گرفت و تغییرات مقدار پرولین، پروتئین کل، رنگیزههای فتوسنتزی، مالون دی آلدهید، فنول و محتوای داخلی پتاسیم برگ اندازهگیری و نتایج از طریق نرمافزار آماری SPSS محاسبه و گزارش شد. نتایج بهدست آمده نشان داد که افزایش دوره تیماردهی توسط نانو کلات پتاسیم و استفاده از غلظتهای بالاتر آن موجب بهبود اثرات مخرب ناشی از تنش خشکی در برخی از پارامترهای اندازهگیری شده در برگ گیاه توتون شد. استفاده از نانو کلات پتاسیم مقادیر پرولین، مالون دی آلدهید و فنول که از نشانههای وجود تنش خشکی هستند را کاهش داد. همچنین باعث افزایش سنتز پروتئین، کاروتنوئیدها و کلروفیلها شد، بهجز در کلروفیل a که شروع تیماردهی با نانو کلات پتاسیم باعث کاهش مقدار آن در چین اول شد که احتمالا بهدلیل کوتاه بودن زمان تیماردهی در چین اول، گیاه فرصت کافی برای جبران کاهش کلروفیل را نداشته است.
کلمات کلیدی: پلی اتیلن گلایکول ، نانو کلات پتاسیم، پرولین، پروتئین کل، رنگیزههای فتوسنتزی، مالون دی آلدهید، فنول پتاسیم.
Abstract
Effect of Patassium Nano Chelates on Physiological and Morphological Properties of COKER Cultivar 347 Tobacco Leaves
Samarqand valeh
Nanotechnology, which deals with matters at extremely small scales, is a new technology that has led to improvements in agriculture and farming over the last few decades. The use of nano-chelates, in lieu of conventional fertilizers, results in the controlled and gradual release of the nutrients throughout the growth seasons. Nano-products consist of mixtures of particles with diameters between 1 to 100 nonometers. The resulting smaller particles for a given volume of a compound give a higher total surface area to volume ratio, increasing the rates of the physico-chemical interactions with the environment of the original compound, as compared with the non-nano analogue. Drought stress is one of the stresses that lead to reduced tobacco farming yields. lower levels of potassium, which is one of the most important elements in tobacco growth and yield production, may be regarded as an indicator of drought stress. Therefore, in such conditions, potassium fertilizers would play an important role in the promotion of tobacco quality and yield. High levels of potassium in plants exposed to drought stress reduce its damaging effects. In this study, we subjected hydroponically-grown tobacco plants to a drought stress using 20% polyethylene glycol 6000, after 48 hours the plants were treated with three concentrations of potassium nano-chelate over 9 days. Variations in the values of phenol, potassium and total protein contents were determined. The data were analyzed using the statistical software of SPSS, The results showed that higher concentrations and longer treatments with nano-chelates of potassium decrease drought-induced deleterious effects on tobacco leaves. Measurement of drought stress indicators revealed lower amounts of proline, malondialdehyde and phenol, That their concentrations are generally elevated in drought-stressed plants. Further biochemical analyses revealed increased protein, carotenoid and chlorophyll content, except for chlorophyll at the first harvesting in plants treated with nano-chelate of potassium. The reduction of chlorophyll a may be due to the sufficient time of the plants exposed to potassium nano chelate treatment.
Keywods: Polyethylene glycol, Potassium nano-chelate, Prolin, Total protein, Photosynthetic pigments, Malondialdehyde, Phenol, potassium.
فصل اول
مقدمه و مرور منابع
1- مقدمه
1-1 تعریف تکنولوژی نانو
انجمن رویال انگلستان، فناوری نانو را تحت عنوان طراحی، توصیف، تولید و کاربرد ساختارها، وسایل و سیستمهایی که دارای شکل و اندازه در مقیاس نانو (1 تا 100 نانومتر) هستند، تعریف نموده است. در چنین مقیاسی قوانین طبیعی حاکم بر پدیدههای فیزیکی و شیمیایی صدق نمی کند (Chinnamuthu, 2009).
1-1-1 تاریخچه نانو تکنولوژی
نانو یک کلمه یونانی به معنای کوتوله یا به معنای چیزی کوچکتر از اندازه معمولی گرفته شده است. در حدود سال 1950 میلادی فیزیکدان معروف آمریکایی، پروفسور ریچارد فاینمن پیشنهاد ساخت یک موتور الکتریکی با ابعاد کمتر از 64/1 اینج را داد و برای کسی که اولین بار موفق به ساخت آن شود، جایزه 1000 دلاری تعیین نمود. سرانجام ویلیام مک لیلان با زحمت فراوان توانست بوسیله یک انبرک دستی و یک میکروسکپ این کار را به انجام برساند. در واقع هدف فاینمن از این کار ایجاد انگیزه در موسسات آموزشی و تحقیقاتی بود تا توجه آنها را به دنیای میکروها و نانوها جلب کند.
فاینمن برای اولین بار و بطور جدی این بحث را در سال 1960 و در انجمن تکنولوژی کالیفرنیا (Caltech) طی یک سخنرانی با عنوان “آن پایین فضای بسیاری هست” مطرح کرد. در طی این سخنرانی فاینمن طریقه نگارش 24 جلد دایره المعارف Britanica را به صورت تئوری بر نوک یک سوزن توضیح داد و بدین ترتیب شاخه جدیدی از دانش پا به عرصه ظهور گذاشت ( Nowack, 2007).
1-1-2 کاربرد تکنولوژی نانو در تولید کودهای کشاورزی
تکنولوژی نانو با کوچک کردن ذرات تا اندازه یک میلیاردم متر، منجر به افزایش نسبت سطح به حجم شده و این ویژگی باعث بروز خواص فیزیکی منحصر به فرد و تاثیرگذاری بیشتر این مواد میشود.
نانوکودها، به دلیل رهاسازی تدریجی و آرام عناصر غذایی خود، بهترین جایگزین برای کودهای محلول مرسوم هستند. با بهرهگیری از نانوکودها، عناصر غذایی به آرامی و با سرعت مناسب در تمام طول فصل رشد گیاه آزاد میشوند و بنابراین به دلیل کاهش شدید آبشویی عناصر، گیاهان قادر به جذب بیشترین مقدار مواد غذایی خواهند بود (Chinnamuthu, 2009).
تحقیقات نشان داد که استفاده از کودهای تهیه شده با فناوری نانو، در مقایسه با کودهای غیرنانو میتواند تاثیرات قابل توجهی بر ویژگیهای فیزیولوژیکی گیاهان داشته باشد.
1-1-3 فواید و معایب نانو تکنولوژی
فناوری نانو پیشرفتهای گستردهای در علم کشاورزی داشته است، از قبیل تولید و فناوری تبدیل ضایعات کشاورزی به انرژی و سایر محصولات جانبی مفید از طریق پردازش نانو زیستی آنزیمی و پیشگیری و درمان بیماریهای گیاهی و غیره (Carmen, 2003). فناوری نانو قادر به تولید نانو حسگرهایی است که در کوچکترین سطوح قادر به تشخیص پاتوژن هستند. همچنین فناوری نانو دارای راه حل برای تجزیه مداوم مواد شیمیایی به اجزای بیضرر و گاهی اوقات مفید است (Baruah and Dutta, et al., 2009).
استفاده از نانو مواد تولید شده، نه تنها بهدلیل خواص منحصر به فردشان دارای مزایایی هستند، بلکه معایب آنها به خاطر استفاده از انرژی زیاد و حجم CO2 تولید شده ناشی از سوختهای دیزلی، گداختن فلزات و حرارت دادن پلیمرهای ساخته شده با فناوری نانو میباشد. از این رو مهم است به منظور افزایش عملکرد اقتصادی و کاهش اثرات زیست محیطی نانو مواد، مزیتهای این تکنولوژی نو پا تقویت شده و در عین حال با معایب آنها مقابله شود (Gao, 2013).
اینگل و همکاران در سال 2008 نشان دادند که در صورتیکه نانو مواد استنشاق شوند در مجاری تنفسی و ریهها رسوب میکنند (Ingle, et al., 2008). در تحقیقی مشابه اثر مخرب نانو ذرات نقره بر التهاب ریه تایید شد (Asharani, et al. 2009).





پاورپوینت درباره برچسب محتوای غذایی مواد مصرفی را بخوانید

پاورپوینت درباره برچسب محتوای غذایی مواد مصرفی را بخوانید

پاورپوینت درباره برچسب محتوای غذایی مواد مصرفی را بخوانید

لینک دانلود و خرید پایین توضیحات
دسته بندی : PowerPoint
نوع فایل : .ppt ( قابل ویرایش و آماده پرینت )
تعداد اسلاید :
27 اسلاید

 

نیاز به کلسیم با سن تغییر میکند

با افزایش سن نیاز به ویتامین D بیشتر می شود

•حداکثر مصرف کلسیم برای سن بالای یک سال 2500mg است.
 
•برای زیر یک سال حداکثری تعریف نشده است.

حداکثر مصرف ویتامین D 800 واحد روزانه است مگر پزشک تجویز کند

تامین کلسیم روزانه: گروه سبزیجات

تامین کلسیم روزانه: گروه گوشت و حبوبات

•ویتامین Dدر پوست در برابر نور خورشید درست می شود
 
•20-30دقیقه در روز سه بار در هفته دستها و بازوها و صورت در معرض نور خورشید باشند.
 
•پوشش بیش از حد، ضد آفتاب، شیشه پنجره و آلودگی هوا مانع از سنتز ویتامن D می شوند.





طراحی و ساخت واکسن کاندید یونیورسال بر علیه ویروس های پاپیلوماانسانی سویه های 6.11.16.18.31.45 بر پایه پروتئین های L1 و L2

طراحی و ساخت واکسن کاندید یونیورسال بر علیه ویروس های پاپیلوماانسانی سویه های 6.11.16.18.31.45    بر پایه پروتئین های  L1 و L2

طراحی و ساخت واکسن کاندید یونیورسال بر علیه ویروس های پاپیلوماانسانی سویه های 6.11.16.18.31.45 بر پایه پروتئین های L1 و L2

خلاصه
سرطان گردن رحم بعد از سرطان سینه دومین سرطان شایع زنان در سراسر جهان می باشد. بیش از 90% سرطان های گردن رحم ، واجد پاپیلوما ویروس های انسانی (HPV)هستند. بیش از 100 نوع مختلف پاپیلوما ویروس انسانی وجود دارد که بیش از 40 گونه ژنوتیپی این ویروس ها، عفونت زا هستند و از آن میان حدود 15 ژنوتیپ، کارسینوژن هستند که تحت عنوان ژنوتیپ های high-risk نام برده می شوند و ژنوتیپ 18 و 16 در بین آنها عامل بیش از 90 % سرطان های مرتبط با این ویروس هستند. پروتئین کپسید L1 پاپیلوما ویروس ها زمانی که در سیستم های بیان کننده پروتئین های یوکاریوتی و پروکاریوتی بیان می شوند ذرات ویروسی مانند غیر عفونی را تشکیل می دهند که باعث القاء پاسخ آنتی بادی خنثی کننده ضد HPVs می شوند. این پروتئین اکنون نیز به عنوان واکسن استفاده می شود و احتمالا وجود پروتئین2 L در واکسن میتواند از طیف گسترده تری از تیپ های ویروسی پیشگیری کند، هرچند که اپی توپ های خنثی کننده آن شبیه به L1 توانایی حفاظت کنندگی را ندارند اما اپی توپ های آن واکنش های متقاطع را به خوبی القا می نمایند. در حال حاضر واکسن هایی که برای ویروس HPV وجود دارد، نمی تواند تمام سروتیپ های پر خطر آن را پوشش دهد و از لحاظ قیمت نیز پر هزینه است.
در تحقیق حاضر طراحی یک واکسن یونیورسال چند اپی توپی برای پروتئین های ساختمانی اصلی ویروس های HPV که شامل L1/L2 است با استفاده از استراتژی های ایمونو انفورماتیک در بررسی 6 نوع پرخطر ویروس HPV سویه های 6،11،16،18،31،45، تلاش در طراحی و ساخت واکسنی شده است که این سروتیپ ها را پوشش دهد ، در این خصوص اقدام به شناسایی بهترین اپی توپ های برانگیخته کننده لنفوسیت هایB ، برای پیشگیری از وقوع بیماری های مرتبط در جهت مطالعه به عنوان کاندید یونیورسال واکسن شد به این ترتیب با در نظر گرفتن بیشترین سطح تحریک شوندگی لنفوسیت های B- اپی توپ های پروتئین های کپسیدی L1 وL2، از نظر قابل دسترس ترین اپی توپ ها با توجه به طراحی سه بعدی آن ها، در نظر گرفتن نواحی N گلیکوزیله شده، هیدروفیلیسیته و آنتی ژنسیته، بهترین اپی توپ ها شامل بیست اپی توپ بیست اسید آمینه ای انتخاب و پس از آنالیزهای مثبت، ساختار نهایی مشتمل بر چهارصد اسید آمینه به صورت DNA طراحی شد و به صورت 1200 نوکلئوتید ترجمه معکوس گردید، سپس در جهت بهترین بیان در E.coli بهینه سازی شد. آنزیم های برش گر BamHI و HindIII به ابتدا و انتهای توالی اضافه و سپس در غالب یک ساختار ژنی در کنار یکدیگر قرار داده شد. ژن طراحی شده مذکور ، توسط شرکت بیوماتیک سنتز شده و در پلاسمید pET28a کلون گردید. پس از دریافت پلاسمید مذکور، در سلول های E.coli BL21DE3 ترانسفرم گردید. بیان پلاسمید نوترکیب در سلول های باکتری با اضافه نمودن 1میلی مولار IPTG در طول 4 ساعت کشت انجام شد و سپس پروتئین توسط ستون کروماتوگرافی Ni-NTA خالص شد و خلوص با تکنیک SDS-page تائید شد و سپس در برابر آنتی بادی anti-His در وسترن بلات مورد تایید قرار گرفت. جهت بررسی ایمنی زایی، واکسن کاندید همراه با ادجوانت فروند ناقص همراه با گروه کنترل PBS به گروه های موشی BALB/c (n=6 ) دو بار و به فاصله 2 هفته بصورت زیر پوستی تزریق شدند که میزان تزریق در هر سری 10 میکروگرم بود. یک هفته پس از دومین واکسیناسیون موش ها ،توتال آنتی بادی ها به روش الایزای غیر مستقیم ارزیابی شدند. نتایج نشان داد که واکسن کاندید تولید شده در میزبان باکتریایی و خالص شده به وسیله ی Ni-NTA، یک باند در حدود 45 کیلو دالتون در وسترن بلات نشان داد. همچنین واکسیناسیون با واکسن کاندید یونیورسال بر پایه ی L1/L2 HPVs منجر به افزایش قابل توجه در پاسخ ایمنی همورال در مقایسه با گروه کنترل شد.
واژه های کلیدی : پاپیلوما ویروس انسانی، پروتئین کپسید L1 و L2 ، چند اپی توپی، یونیورسال واکسن
فهرست مطالب
عنوان صفحه
ضمائم:
فهرست اشکال :
شکل 2-1.ساختمان ویروس پاپیلوما16
شکل 2-2. نقشه ژنومی در پاپیلوما ویروس18
شکل2-3.نمایی از تکثیر پاپیلوما ویروس در ارتباط با عملکرد پروتئین های غیرساختاری18
شکل2-4. مواردی از عفونت پاپیلوما ویروس ها30
شکل 2-5. مراحل اصلی پاپیلوماویروس و محل آنها در اپی تلیوم اسکوآموس41
شکل 2-6. ساختار شماتیک و توالی ژنی ناحیه بیانی pET-28a99
شکل4-1. نمایش انتخاب اپی توپ ها با میزان بالای قابلیت دسترسی به حلال ، در اینجا ساختمان های پروتئین L1 از سروتایپ های HPV 11, 16, 18, 31, 45 نشان داده شده اند.............................................................................................151
شکل4-2.طراحی اولیه ساختار اپی توپ های منتخب ، E1 تا E10 برای پروتئین L1 و E11 تا E20 برای L2 طراحی شدند......................................................................................................................................................................................155
شکل 4-3. آنالیز آنتی ژنی سیتی ساختمان توسط برنامه پروتئان آنالیز ،. این نتایج نشان داد که قسمت های اصلی ساختار پروتئنی جدید خصوصیات هیدروفیلیک دارد، بنابراین توان آنتی ژنیک را دارد.....................................................................157
شکل4-4. توالی ترجمه شده معکوس برای بهینه سازی کدون و کدون نادر برای افزایش سطح بیان ژن و انحلال پذیری پروتئین ارزشیابی شد. به این منظور OPTIMIZER و سرورهای GenScript با هم بکار برده شدند.......................158
ششکل 4-5. نتایج ترجمه معکوس و بهینه سازی ...............................................................................................................159
شکل 4-6.نتایج تایید بیان پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی و مشاهده باند در محدوده 45 کیلو دالتون.....................................................................................................................................................................................160
شکل4-7. pET28a(+)/HPV، SDS-PAGE قبل و بعد از تخلیص پروتئین ، نتیجه تخلیص به صورت تک باند و در محدوده 45KD است.............................................................................................................................................................160
شکل4-8. نتایج Western Blot و SDS-PAGE ، نتیجه در محدوده 45KD است.....................................................161
شکل4-9. SDS-PAGE بعد از تخلیص انبوه پروتئین ، نتیجه به صورت تک باند و در محدوده 45KD است..............162
فهرست جداول:
جدول 2-1. خصویات واکسن چهار ظرفیتی و دوظرفیتی HPV ...........................................................................................53
جدول 2-2.واکسن های پیشگیری کننده در حال توسعه.........................................................................................................61
جدول2-3.واکسن های درمانی HPV درحال توسعه..............................................................................................................62
ﺟﺪول2-4.ﭘﺎﯾﮕﺎه داده اپی توپ ها و ﺳﺎﺧﺘﺎرهای آﻧﺘﯽ ﺑﺎدی ﺑﺮای ﺳﻠﻮل B ﻣﺨﺘﻠﻒ ..............................................................72
ﺟﺪول 2-5. ﺗﻌﺪادی از اﺑﺰارهای ﻣﻮﺟﻮد جهتﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ هایﺳﻠﻮل B ...................................................................75
ﺟﺪول 2- 6 . ﻣﻨﺎﺑﻊ ﻣﻮﺟﻮد جهتﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ هایﺳﻠﻮلB .......................................................................................80
جدول3-1. سکانس های استفاده شده برای طراحی ساختار کاندید یونیورسال واکسن HPV............................................105
جدول3-2.گروه بندی موش های مورد مطالعه.....................................................................................................................141
جدول 4-1. پیش بینی اپی توپ سروتیپ های HPV 11.16.18, 31, 45 با استفاده از سرور BCPREDS...................149
جدول 4-2.فهرست نتایج مدل سازی همولوژی برای پروتئین های L1 از HPV نوع های 11، 16، 18، 31 و 45...........150
جدول4-3. امتیاز و محدوده آسپاراژین در توالی اپی توپ ها را نشان می دهد..................................................................153
جدول4-4. 20 اپی توپ مناسب انتخاب شده از پروتئین های L1 و L2 ........................................................................154
جدول 4-5. نتایج طراحی پروتئین و محاسبه پارامترهای مربوطه.........................................................................................156
فهرست نمودار ها :
نمودار 4-1. نتایج بررسی سطح آنتی بادی توتال در گروههای تجربی...............................................................................163
فصل اول
مقدمه
مقدمه:
پاپیلوما ویروس ها، گروهی از ویروس های DNA دار هستند که باعث ایجاد زگیل یا پاپیلوم در انواعی از مهره داران عالی از جمله انسان ها می شوند. همچنین بعضی از پاپیلوما ویروس ها می توانند در حیوانات و انسان ها بدخیمی ایجاد کنند. تعدادی از پاپیلوما ویروس ها به عنوان عوامل ایجاد کننده سرطان گردن رحم و سایر تومورهای اپی تلیال مطرح شده اند (1). این ویروس ها، ذراتی کروی، کوچک و بدون پوشش با اندازه ای حدود 55 نانومتر هستند که کپسید آنها تقارن بیست وجهی دارد و ژنوم DNA دو رشته ای خطی این ویروس را در بر می گیرد (6،5،4،3،2). این ویروس ها کاملا اختصاصی گونه و بافت می باشند و در سلول های اپی تلیال پوست و مخاط تکثیر می شوند و برای ایجاد عفونت پایا باید سلول های بازال را آلوده کنند (4،1).
علیرغم تنوعی که در پاپیلوماویروس ها وجود دارد، تشابه بسیار زیادی در سکانس پروتئینی و نوکلئوتیدی اعضای خانواده پاپیلوماویروس وجود دارد و ژنوم های مجزا، سازماندهی ژنتیکی مشابهی دارند (7). ژنوم این ویروس ها از 3 ناحیه مجزا تشکیل شده است که شامل ناحیه کنترلی غیر کد کننده ، ناحیه اولیه و ناحیه تاًخیری می باشد. ناحیه کنترلی حاوی توالی های تنظیمی است. ناحیه اولیه شش پروتئین غیر ساختمانی اولیه E1, E2 E4, ,E5, ,E6 ,E7 و ناحیه تاخیری، دو پروتئین کپسیدی L1 و L2 را کد دهی می کند (9،8،1). کپسید ویروس از دو پروتئین ساختمانی تشکیل شده است. پروتئین کپسید اصلی یا L1 دارای وزن مولکولی حدودا 55 کیلو دالتون است که تقریبا 80 درصد کل پروتئین های ویروس را شامل می شود (10). پروتئین کوچک یا L2 تقریبا 70 کیلو دالتون است و در کپسید ویروس جای دارد. ذرات شبه ویروسی یا VLP از پاپیلوما ویروس های مختلف به وسیله بیان ژن L1 به تنهایی یا همراه پروتئین L2 در سیستم های بیان کننده پستانداران و غیرپستانداران تولید شده است (12،11). بیان پروتئین L1 در E.coli باعث تولید ذرات شبه ویروسی کوچک می شود. این ذرات پنتامر 12 تایی بوده و دارای ساختار 20 وجهی هستند. این ذرات شبه ویروسی به خوبی سیستم ایمنی هومورال را تحریک میکنند و بعنوان واکسن پروفیلاکتیک استفاده میشوند (13). پروتئین L2 در تجمع کپسید ویروس نقش دارد و در ضمن دارای اپی توپهای خنثی کننده نیز می باشد. احتمالا وجود پروتئین2 L در واکسن میتواند از طیف گسترده تری از تیپ های ویروسی پیشگیری کند. هرچند که اپی توپ های خنثی کننده آن شبیه به L1 توانایی حفاظت کنندگی را ندارند اما اپی توپ های آن واکنشهای متقاطع را القا می کنند (14،15،16 و 17).
پروتئین های اولیه E1 و E2 برای تکثیر و باقیماندن ژنوم ویروس مورد نیاز می‌باشند. پاپیلوماویروس های انسانی، پروتئین E3 را ندارند. پروتئین E4 از ناحیه اولیه کد می شود اما در مراحل تاًخیری عفونت بیان شده، باعث گریز ویروس از سلولهای آلوده می گردد (4،2). E5 یک پروتئین انکوژن است که رسپتورهای اختصاصی فاکتور رشد را فعال می کند و در ترانسفورمیشن خوش خیم نقش دارد(2). E6 وE7 انکوپروتئین های اصلی پاپیلوماویروس را کد می کنند. انکوپروتئین E6 مانند پروتئین E1B آدنو ویروس تیپ 5 و آنتی ژن T بزرگ ویروس SV40 قادر است به پروتئین سرکوب کننده تومور پروتئین های P53 و E6 باعث ممانعت از تعمیر DNA آسیب دیده یا ممانعت از القاء مرگ برنامه‌ریزی شده می گردد و در نهایت باعث تجمع جهش های ژنتیکی درسلول‌های آلوده شده و سلول ها رشد بی رویه ای را آغاز می کنند و سرانجام به صورت سرطانی در می آیند (18).
بیش از 200 تیپ پاپیلوما ویروس انسانی شناسایی شده است که تفاوت های ژنومی در توالی های DNA دارند (19،5) . پاپیلوماویروس های انسانی قادرند سلول های اپی تلیال بازال پوست و دیواره داخلی بافت ها را آلوده کنند و بر این اساس به انواع پوستی و مخاطی طبقه بندی می شوند. انواع مخاطی می توانند دیواره دهان، گلو ، دستگاه تنفس یا اپی تلیوم آنوژنیتال را آلوده نمایند و براساس ارتباط آنها با سرطان گردن رحم و جراحات پیش ساز ، به انواع پر خطر ، با خطرمتوسط و کم خطر تقسیم بندی شده اند (1، 20 ،21).
سرطان گردن رحم دومین سرطان شایع در زنان جهان است و بروز جهانی آن، سالانه بیش از 400000 مورد می باشد. حدود 80 درصد موارد سرطان های گردن رحم در کشورهای در حال توسعه اتفاق می افتد . همچنین شیوع انواع HPV ژنیتال و کارسینومای گردن رحم در کشورهای جهان سوم بسیار بالا است (22،23،24). درمان هایی که برای تومورهای پیش بدخیم وجود دارد مانند برداشتن با جراحی یا تخریب آنها با لیزرتراپی یا کرایوتراپی ، ممکن است گاهی اوقات منجر به نازایی شود. از آنجائیکه بیشتر زنانی که تحت تاثیر قرار می گیرند هنوز درسن باروری هستند، روش های درمانی دیگر دردست بررسی می باشند(25).
واکسن های مختلفی برای پیشگیری از عفونت های ویروسی استفاده می شوند. که شامل واکسن های ویروس کشته شده، واکسن های حاوی ویروس زنده تخفیف حدت داده شده، واکسن های پروتئین های خالص شده، واکسن های ویروسی نوترکیب، واکسن های پپتیدی ، واکسن های DNA و ... می باشد . در مورد پاپیلوماویروس انسانی به دلیل عدم وجود سیستم های کشت سلول و نیز وجود انکوژن ها در ژنوم این ویروس ها ، استفاده از واکسن های پاپیلوما ویروسی زنده تخفیف حدت داده شده یا ویریون های کامل غیر فعال شده که حاوی DNA ویروسی هستند، محدود شده است(27،26 ).
واکسن های پروتئین های خالص شده و واکسن های پپتیدی نیز روش های تولید و تخلیص نسبتا مشکلی دارند و در مورد واکسن های ویروسی نوترکیب نیز علاوه بر روش تولید و تخلیص مشکل، دارای سیستم های تحویل پیچیده‌ ویروسی هستند. بعلاوه ممکن است پاسخ ایمنی علیه وکتور ویروسی ایجاد شود که باعث ناکارآمدی واکسن می گردد. همچنین بسیاری از واکسن های زیرواحدی قادر به القای لنفوسیت های Tسایتوتوکسیک نمی باشند و به نگهداری در یخچال نیاز دارند و در نهایت واکسن‌هایی که با این روش ها تولید می شوند برای جمعیت عمومی مخصوصا در کشورهای در حال توسعه، گران هستند و نگرانی هایی در مورد سلامت آنها وجود دارد(26،27،28،29).
در این مطالعه سعی بر طراحی نوعی واکسن یونیورسال (universal vaccine) پاپیلومای انسانی شده است البته در تعریف این واکسن میتوان گفت واکسنی است که در آن از اپی توپ های پروتئین های سطحی ارگانیسم های یک خانواده یا مرتبط به هم (در خانواده مجزا) استفاده گردد چنین واکسنی قادر است هم زمان علیه تمام ارگانیسم های مذکور حفاظت ایجاد نمایید(30).
از مزیت های واکسن یونیورسال این است که هزینه ی مصرف کننده را کم می کند و در واقع با یک واکسن بر علیه گونه های مختلفی محافظت ایجاد می کند که باعث کاهش هزینه های شرکت های واکسن سازی نیز می شود. در طی چند سال گذشته واکسن یونیورسال بر ضد ویروس انفلوانزا طراحی شده است که این واکسن یونیورسال به جای اینکه به پروتئین های لایه خارجی ویروس که قابل جهش یافتن و تغییر هستند آسیب برساند به پروتئین های کانال یونی ویروس که در تمام گونه های ویروس انفلوانزا مشترک هستند حمله می کند (31).
در حقیقت در واکسن یونیورسال هدف این است که با استفاده از یک سری اپی توپهای حفاظت شده بتوان پاسخ ایمنی را بر ضد ویروس اصلی ، زیر نوع های آن ویروس و استرین های جدید از این ویروس القا نمود که به جامعیتی کلی منتهی شود. انتی بادی ها و یا پاسخ ایمنی ضد نواحی نسبتا ثابت پروتئین های سطحی ویروس ها موجب القا پاسخ محافظتی، حتی نسبت به گو نه های نزدیک می گردد که به این فرایند Hetero or Heterosubtypeic immunity اطلاق می گردد. در بررسی های انجام شده بر روی واکسن های انسانی مشخص گردید که در چنین فرایندی هر دو شاخه از ایمنی اختصاصی نقش دارند.(32،33)
بررسی ها نشان می دهد که تا به حال هیچ واکسن یونیورسالی برای ویروسهای پاپیلوما معرفی نشده است با توجه به مزیتهای ذکر شده در این تحقیق برای اولین بار در دنیا یک واکسن یونیورسال برای پاپیلوما بعنوان واکسن کاندید تولید می گردد (34).
. در حال حاضر انکو پروتئین های L1 و L2 پاپیلوما ویروس ، قابل اعتمادترین اهداف به منظور تولید واکسن پیشگیری HPV هستند، زیرا این مولکول ها ، پروتئین های ویروس هستند که باعث اتصال به سلول هدف می شوند. درحقیقت به نظر می رسد وجود این مولکول ها شرط لازم برای اتصال و ورود ویروس به داخل سلول ها باشد (25).
به طور کلی ایمنی هومورال باعث جلوگیری از گسترش ویروس به مکان جدید برای تکثیر و جلوگیری از عفونت مجدد می شود. این عفونت معمولا اختصاصی تیپ است (35). وقتی چندین زگیل به طور همزمان وجود دارد اگر یکی از آنها را برداریم غیر معمول نیست که دیگر زگیل ها پسرفت کنند و این حالت بیانگر آزاد شدن آنتی ژن و شروع پاسخ ایمنی است (36). ناتوانی برای تولید و تهیه مقدار زیادی از ویروس و وجود انکوژن هایی در ویروس باعث گرایش به واکسن های نوترکیب برای این ویروس شده است (36).
همان طور که گفته شد پروتئین های L1 و L2 توانایی خود تجمعی دارند و به شکل VLP به خوبی می توانند باعث القاء سیستم ایمنی هومورال شوند و از عفونت HPV جلوگیری کنند. در واقع اپی توپ های خنثی کننده بر روی این سازه ها وجود دارند و این سازه ها به شکل ذرات تو خالی شبیه ویروس هستند. این ذرات بسیار ایمونوژنیک بوده و تیتر بالایی از آنتی بادی اختصاصی تیپ را القاء می کنند. این ایمنی به صورت دوره طولانی وجود دارد و با انتقال IgG به صورت غیر فعال می تواند نقش حفاظت کننده داشته باشد (37).
در این مطالعه اپی توپ های خنثی کننده L1 و L2 بعد از طراحی، انتخاب و در وکتور بیانی PET-28a بصورت کلون شده تهیه گردید سپس بیان آن مورد ارزیابی قرار گرفت و پس از خالص سازی، به مدل موش آزمایشگاهی تزریق و پاسخ آنتی بادی مورد ارزیابی قرار گرفت.
امروزه واکسن های پیشگیری کننده موثری علیه این ویروس وجود دارد که قیمت بالایی داشته و در حال حاضر جزء برنامه عمومی واکسیناسیون در اغلب کشورها از جمله ایران نمی باشند، بنابراین با توجه به وجود بیماران مبتلا به سرطان ناشی از این ویروس و اینکه تا آینده نزدیک کاهش سرطان ناشی از واکسیناسیون محسوس نخواهد بود، تحقیقات زیادی بر روی واکسن های درمانی این نوع سرطان متمرکز شده اند که برخی از آنها در فازهای مختلف کارآزمایی بالینی می باشند.
از مزیت های واکسن یونیورسال هزینه ی مصرف کننده را کم می کند و در واقع با یک واکسن بر علیه گونه های مختلفی محافظت ایجاد می کند که باعث کاهش هزینه های شرکت های واکسن سازی نیز می شود.
از سوی دیگر چنین واکسنی قادر است انواع گونه های پاتولوژیک چه سرطان زا و چه ویروسهای زگیل زا را مهار نماید و از این حیث که این ویروس در طیف قابل توجهی از جامعه ،سرطان گردن رحم و زگیل های پوستی ایجاد می نماید این واکسن به عنوان یک واکسن مقرون به صرفه می تواند در افزایش بهداشت جامعه کمک شایانی نماید.
فصل دوم
کلیات و مروری بر مطالعات گذشته
2-1- تاریخچه
پاپیلوماویروس ها گروهی از ویروس‌های کوچک هستند که در بسیاری از مهره داران بزرگ از جمله انسان، زگیل هایی را ایجاد می کنند. این ویروس ها توانایی ایجاد بدخیمی در انسان و حیوانات را دارند. بعضی از پاپیلوماویروس های انسانی عامل ایجاد سرطان گردن رحم و تومورهای اپی تلیالی دیگر هستند. زگیل‌های تناسلی در زمان یونان باستان و روم شناسایی شده بودند و طبیعت عفونی بودن آنها مشخص شده بود اما تا قرن 19 زگیل‌های تناسلی را مربوط به سیفلیس و یا گونوره می دانستند. کایفو اولین بار بیش از 90 سال پیش، طبیعت ویروسی زگیل‌های انسانی را ثابت کرد(38). ریچارد شاپ در سال 1933 اولین پاپیلوماویروس حیوانی را که پاپیلوماویروس خرگوشی می باشد، شناسایی کرد(39). در اواخر دهه 1960 آلمدیا و همکارانش با استفاده از میکروسکوپ الکترونی ذرات HPV را در زگیل های تناسلی نشان دادند و در سال 1967 این ویروس ها درخانواده پاپوا ویروس انسانی قرار گرفتند. در دهه 1970 مشخص شد که پاپیلوماویروس انسانی ، تیپ های متعددی دارد و تشخیص سرطان گردن رحم در آزمایشگاه های آسیب شناسی با آزمایش های هیستوپاتولوژی امکان پذیر شد. در سال 1976، زارهاسن، برای اولین بار تشخیص داد که بین وجود زگیل های جنسی و سرطان گردن رحم ارتباط معنی داری وجود دارد(12). در اوایل دهه 1980 پاپیلوماویروس انسانی تیپ 16 از بیوپسی سرطان گردن رحم ایزوله و شناسایی گردید و بعد مشخص شد که یکی از مهمترین تیپ های سرطان زای پاپیلوماویروس انسانی می باشد. درسال 1981 اولین ژنوم پاپیلوماویروس در وکتور باکتریایی کلون شد (39).
گرین و همکاران در سال 1982 نشان دادند که توالی DNA پاپیلوماویروس های انسانی در تومورهای مثبت بیشتر به شکل مولکول های DNA ویروسی آزاد وجود دارند (40). درسال 1985 ، لین و همکاران مشخص کردند که درنمونه های بیوپسی کارسینومای گردن رحم، DNA پاپیلوماویروس انسانی تیپ 16 بطور کووالانسی به DNA سلول توموری متصل می شود (41). در سال 1986 تسونوکاوا و همکاران نشان دادند که نمونه DNA ژنومی سرطان گردن رحم واجد پاپیلوماویروس انسانی تیپ 16 قادر است سلول های 3 NIH 3Tرا به طور بدخیم ترانسفورم نماید (42). در همان سال سموتکین و وشتین پروتئین E7 را درسلولهای Caski شناسایی کردند و به دلیل وجود شایع mRNA آن در این سلول ها پیشنهاد کردند که ممکن است این پروتئین در ایجاد یا باقیماندن حالت بدخیمی موثر باشد (43). در سال 1989 مونگر و همکاران و واتنب و همکاران در دو گزارش جداگانه نشان دادند که ژنهای E6 و E7 ویروس HPV16 کراتینوسیت های گردن رحم یا فورسکین انسانی را نامیرا می کنند (44،45). در سال 1988 مک کنسی و همکاران ، نقش HPV 16 را به عنوان عامل موثر در پیشرفت نئوپلازیای تناسلی مشخص کردند (46). در سال 1990 رسنیک و همکارانش روش PCR‌ را برای تشخیص و تیپ بندی طیف وسیعی از سکانس های پاپیلوماویروس های انسانی تناسلی راه اندازی کردند (47). در سال 1991 شن و همکارانش نشان دادند که موش های ایمن شده با سلول های فیبرو پلاستی غیرتومورژنیک بیان کننده HPV 16 E7 در برابر چالش با سلولهای ملانومای توموژنیک بیان کننده HPV16E7 محافظت شدند (48). در سال 1991 تیندل و همکارانش با بکار بردن پپتیدهای ساختگی، یک اپی توپ اصلی TH را در E7 مشخص کردند (49). در همان سال زیلیدی و همکارانش، در مطالعه نمونه های گردن رحم نرمال در کنیا، نتایجی شبیه مطالعه ای که درسوئد انجام شده بود، به دست آوردند و نشان دادند که از 77 نمونه آزمایش شده با PCR ، 15 نفر ( ٪5/19) از نظر HPV تناسلی مثبت بودند که از این تعداد 4 نفر HPV16، 3 نفر HPV18 و یک نفر HPV6 و HPV33 مثبت بودند (24) . در سال 1992 ایواندر و همکارانش، شیوع پاپیلوما ویروس ها را در زنان جوان سوئدی با استفاده از PCR بررسی کردند که در این مطالعه ، نمونه جمع آوری شده ، سلول های تراشیده شده از گردن رحم بود و شایع ترین تیپ های HPV در این نمونه ها تیپ 6(٪ 20) و تیپ 16 (٪ 27) بودند (50). در همان سال هک و همکارانش مقایسه ای بین جایگاه های اتصال HPV های تناسلی که تعیین توالی شده بودند، انجام دادند و نشان دادند که یک تفاوت اسید آمینه ای ثابت (آسپارتیک اسید / گلایسین) بین ویروس های پر خطر و کم خطر وجود دارد (51). همچنین در سال 1992 لورینکز و همکارانش در مطالعه‌ای انجام دادند و مشخص کردند که میزان HPV 16 در سرطان ها و جراحات داخل اپی تلیالی اسکواموس درجه بالا (High – grade) ، ٪1/47 است (21). درسال 1995 بوش و همکارانش ، شیوه پاپیلوماویروس انسانی را در سرطان گردن رحم بررسی کردند و در این مطالعه نشان دادند که HPV16 در تومورهای سلولی اسکواموس در ٪51 موارد وجود دارد (22). در همان سال شن و همکارانش ، به منظور تعیین تیپ بندی، فیلوژنی و طبقه بندی، آنالیز توالی های ژنتیکی 95 تیپ پاپیلوماویروس را انجام دادند . دراین مطالعه پاپیلوماویروس ها، به سوپر گروه های E,D,C,Z,B,C با تفاوت های بیوشیمی کاملا مشخص، تقسیم بندی شدند و هر سوپر گروه به چندین گروه تقسیم بندی شد. براساس این مطالعه HPV16 در سوپر گروه A و در گروه A9 قرار می گیرد (52). در سال 1996 ژاکوبز و همکارانش یک روش PCR-EIA را برای تشخیص سریع 14 ژنوتیپ پر خطر و 6 ژنوتیپ کم خطر پاپیلوماویروس انسانی در نمونه های سواپ های گردن رحم با استفاده از پرایمرهای عمومی طراحی کردند که این روش اجازه داد تا شناسایی سریع و صحیح تیپ های HPV پر خطر و کم خطر در سواپ های گردن رحم انجام شد و تشخیصHPV در برنامه های غربالگری انبوه HPV تسهیل گردد (53). درسال 1997 کوپ و همکارانش مقایسه بین دو روش آزمایش Hybrid Capture Tube و PCR را برای تشخیص HPV DNA در نمونه های سرطانی انجام دادند و نشان دادند که روش PCR حساسیت بیشتری دارد (54). در سال 1998 مشد و همکارانش چهار روش ساندویچ الایزا را برای تشخیص آنتی بادی ها ایجاد شده علیه پروتئین های E6 و E7 تیپ های 16 و18 راه اندازی کردند که از آنها می توان برای پیگیری کارآزمایی های ایمنولوژیک E6 و E7 استفاده کرد (55). در همان سال زازو و همکارانش نشان دادند روش PCR برای تشخیص HPV DNA به منظور پیش بینی جراحات گردن رحم مربوط به HPV، میزان منفی کاذب بسیار پایینی دارد (56). در سال 1999 شی و همکارانش یک DNA واکسن HPV16 را که در دو ORF آن جهش ایجاد کرده بودند ، تهیه کردند و با بررسی پاسخ لنفوسیت های T سایتوتوکسیک نشان دادند که این واکسن پاسخ قویتر CTL اختصاصی E7 را القا می کند (57). در سال 2002 مایکل و همکارانش پاسخ های سلول T بهHPV16 E7در موش با چهار روش ، ارزیابی رها شدن Cr ، تولید IFN- داخل سلولی ، ELISPOT و رنگ آمیزی Tetramer انجام دادند و این روش ها را با هم مقایسه کردند. روش پیشنهادی این گروه روش ELISPOT بود زیرا این روش می تواند وجود سلول های T فعال شده یعنی IFN- ترشح شده را در یک روش کمی همراه با حساسیت بالا و سلول T مورد نیاز نسبتا پایین مشخص کند (25). در سال 2002 مایکل و همکارانش در گزارشی دیگر نشان دادند که با استفاده از فیوژن پروتئین های HPV16 E7 در واکسیناسیون DNA می توان ایمنی زایی آن را افزایش داد (26). در سال 2002 کدیش و همکارانش، پاسخ های ایمنی سلولی به پپتیدهای E7 و E6 پاپیلوماویروس تیپ 16 را ارزیابی کردند و نشان دادند که پاسخ های ایمنی سلولی به پپتید E7 ارتباط معنی داری با بهبودی بیماری دارد (58). در همان سال لیچمن و همکارانش پروتئین E6 ویروس CRPV را به یک منومر یوبی کوئیتین متصل کردند و نشان دادند که خرگوش هایی که با ژن E6 تیپ وحشی همراه با GM-CSF و یا با ژن E6 متصل شده به یوبی کوئیتین واکسینه شده بودند، نسبت به گروه کنترل به طور معنی داری، پاپیلوم در آنها کمتر شده بود (59). در سال 2003، لین وهمکارانش دریافتند که تزیق اولیه رپلیکون ویروسی سیند یبس واجد E7/HSP70 و تزریق واکسینا E7/HSP70 به عنوان بوستر بیشتر سلول‌های TCD8+ اختصاصی را ایجاد می کند (60). در همان سال کوتشا و همکاران نشان دادند که در روش واکسیناسیون با ژن، روش Prime-boosting به منظور ایجاد سطح بالاتر پاسخ سلول های T اختصاصی تومور ضروری است (61). در سال 2003، لفور و همکارانش با انجام تحقیقی نشان دادند که استفاده از کنترل داخلی در Real – time PCR به منظور اندازه گیری HPV 16 می تواند وجود مهار کننده های موجود در نمونه ها را مشخص نماید (62). در سال 2004، شنگ و همکاران پلاسمیدی طراحی کردند که واجد ژن L1-E7 و در آن کدون های بیان شونده در سلول های پستانداران را قرار دادند. همچنین جهش هایی در ژن E7 ایجاد کردند که باعث کاهش سرطان زایی آن شد. آن ها نشان دادند که این پلاسمید موثرتر از پلاسمید حاوی E7 و L1 ( بدون بهینه سازی کدون های مورد استفاده ) است و می تواند در برابر تومور بیان کننده E7 ، محافظت کننده باشد (63). در همان سال، پنگ و همکاران ثابت کردند که ناحیه اسید آمینه 48 تا 57 از ژن E6 محتوی اپی توپ های ایمنو دومینانت است و می تواند در کنترل عفونت HPV و جراحات مرتبط با HPV مفید باشد (64). در سال 2004، هالز و همکارانش واکسن پروتئینی E7 پاپیلو ما ویروس انسانی تیپ 16 را دربیماران مبتلا به نئوپلازی داخل اپی تلیالی HPV انکوژنیک مثبت کارآزمایی بالینی کردند و پاسخ آنتی بادی و پاسخ سلولی اختصاصی آنتی ژن را ارزیابی نمودند و نشان دادند که همه افراد واکسینه شده، IgG اختصاصی E7 را تولید نمودند و در بیشتر آنها پاسخ های ایمنی سیستمیک ایجاد شد و تعدادی از آنها نیز پاسخ ایمنی سلولی طولانی مدت نسبت به E7 را نشان دادند (65). در سال 2005 کیونگ ون هو و همکارانش کمپلکس پروتئین های سلولی همراه با HPV16 E7 را تخلیص کردند و پروتئین سلولی P600 را به عنوان هدف دیگر E7 در سلول شناسایی نمودند(66). در سال 2005 یانگ و همکاران با بکار بردن تکنیک MassARRAY توانستند DNA پاپیلوماویروس انسانی تیپ 16 را در سرم و یا بخش های مختلف خون محیطی افراد درمان نشده مبتلا به دیس پالازیای درجه بالای گردن رحم، تشخیص دهند (67).
از سوی دیگر تجربیات موفقی بر روی واکسن های یونیورسال برای برخی پاتوژن ها وجود دارد برای مثال
در سال 2006 Giuliani همکارانش برای اولین بار از 5 آنتی ژن کشف شده توسط واکسینولوژی معکوس در یک فرم مناسب برای تولید با ادجوانت مناسب MF59 برای ساخت واکسن یونیورسال منگوکوک استفاده کردند این واکسن توانایی بالقوه بسیار بالایی را در غلبه بر یکی از انواع بیماریهای مخرب در کودکان داشت (68). در سال 2006 Ernestو همکارانش نیز مبادرت به ساخت واکسن یونیورسال انفلوانزا بر اساس پروتئین M2e نمودند آنان در تحقیق خود پروتئینA M2e را از H1N1 و H5N1 و H9N2 در ادجوانت لیپوزومی فرموله نمودند و آن را به عنوان یک واکسن یونیورسال در مدل موش آزمایشگاهی مورد ارزیابی قرار دادند و مشاهده کردند که تیتر آنتی بادی IGg1 بشدت افزایش پیدا کرد. تاکنون این واکسن بر روی موش ها و میمون ها آزمایش و نتایج آنها با یکدیگر مقایسه شده و نشان داده است که این حیوانات پس از دریافت این واکسن به طور مثبتی توانستند در مقابل عفونت تجربی ویروسهای انفلوانزا مثل 1934 H1N1 به خوبی واکنش نشان دهند . در این استراتژی در ابتدا یک دوز از DNA رمزگشایی یک پروتئین ویروس انفلوانزا به نام "هماگلوتنین" (HA) و در نوبت دوم یک ویروس انفلوانزای فصلی که بخش هایی از ژنتیک ویروس آن اصلاح ژنتیکی شده تزریق می شود. این دانشمندان معتقدند که این گامی بزرگ به سوی توسعه یک واکسن ضد انفلوانزای واحد است که با تکنیک دو بار تزریق می تواند بدن را ایمن کند (33). در سال 2010 Goldstein و Chicca موفق به ساخت یک واکسن یونیورسال اپی توپ ضد tat HIV-1 شدند. واکسن ضد tat علیه اپی توپ (TUTI 16) آنتی بادی های خنثی کننده tat تولید می کند. TUTI 16 تیتر آنتی بادی را در هر 8 نوع شناخته شده از اپی توپ tat بالا میبرد (30). در سال 2010 پایک و همکاران طی مطالعاتی که برای طراحی یونیورسال واکسن انجام دادند از باسیل مایکوباکتریوم بویس (BCG-CWS) به عنوان یک یونیورسال واکسن برای حذف طیف گسترده ای از آنتی ژن ها به منزله دستیابی به موفقیت برای توسعه واکسن عفونت های بیماری های آلرژیک و سرطان استفاده کردند. در ساخت این واکسن از ادجوانت Freunds استفاده کردند که بشدت پاسخ ایمنی Th1 و بیان IFN-γ را تحریک کرد .همچنین antigen-conjugated BCG-CWS vaccine یک واکسن با ساختار ساده ، راحت و قابل استفاده است و mycobacterial CWS بعنوان یک یونیورسال واکسن توانست در مقابل عفونت ، آلرژی و سرطان زایی این عامل بیماریزا یک پیشگیری کننده مناسب باشد (31). در سال 2012 Sharma و همکاران وی به دلیل سروتایپ های بالای باکتری استرپتوکوکوس در مناطق مختلف جهان و ایجاد بیماری خود ایمنی ساخت واکسن یونیورسال برایgroup A Streptococcus) ( GAS را نیاز فوری دانستند. آنها 147 پروتئین را به عنوان نامزدهای واکسن یونیورسال انتخاب کردند که با تجزیه و تحلیل پروتئین سطحی در گونه های مختلف استرپتوکوکس (M1 – M49) در نتیجه پروتئین 52 را به عنوان نامزد احتمالی برای واکسن یونیورسال برای GAS مناسب دانستند و پیش بینی کردند که حتی استفاده از این پروتئین در جهت ساخت واکسن یونیورسال برای سایر باکتری های پاتوژنیک با تعداد سویه بالا و تنوع ژنتیکی زیاد بسیار مناسب خواهد بود (32).
2-2- طبقه بندی
در تحقیقات اولیه در طبقه بندی پاپیلوماویروس ها، از زگیل های معمولی و جراحات E7 بیماران ، جهت جداسازی تعداد زیادی از ذرات ویروسی و تهیه DNA آنها استفاده شد. در این زمینه ، در اواخر دهه 1970 موافقت شد تا سیستم شماره گذاری به منظور شناسایی یک تیپ استفاده شود که براین اساس، به طور مثال HPV1 نشان دهنده پاپیلوماویروس انسانی تیپ یک می باشد (5).
در گذشته پاپیلوماویروس ها و پولیوما ویروس ها در خانواده پاپوا ویریده قرار می گرفتند . این طبقه بندی براساس شباهت آنها در داشتن کپسیدهای بدون پوشش، اندازه کوچک، جایگاه تکثیر DNA و ژنوم DNA دو رشته ای حلقوی بود. بعدها مطالعات زیست شناسی مولکولی مقایسه ای نشان داد که تفاوت های اساسی در سازماندهی ژنومی پاپیلوما ویروس ها و پولیوما ویروس ها وجود دارد . بدین ترتیب این ویروس ها در دو خانواده ویروسی مجزای پاپیلوماویریده و پولیوماویریده قرارگرفتند (1،39).
پاپیلوماویروس ها گروه متنوعی از ویروس ها هستند که در بیش از 20 گونه مختلف از پستانداران و همچنین در پرندگان و خزندگان نیز یافت می شوند. به علت اهمیت پزشکی ، پاپیلوماویروس های انسانی به طور گسترده ای مورد مطالعه قرار گرفته اند و در حال حاضر بیش از 200 تیپ مختلف از آنها شناسایی شده است و ممکن است تیپ های ویروسی بیشتری هم شناسایی شوند (69،1).
2-3- ساختمان ویریون
پاپیلوماویروس ها، ویروس هایی کوچک، بدون پوشش و دارای نوکلئوکپسید با تقارن بیست وجهی با اندازه ای حدود 55-52 نانومتر می باشند (1،39،70).
شکل 2-1: ساختمان ویروس پاپیلوما
2-4- ساختمان و سازماندهی ژنوم
ژنوم های بسیاری از پاپیلوماویوس های حیوانی و انسانی بطور کامل تعیین توالی شده اند. ژنوم پاپیلوماویروس ها به صورت DNA دو رشته ای است که از دو انتها به صورت کووالان به هم متصل شده و حالت حلقوی به خود می گیرند. اندازه ژنوم آن تقریبا هشت کیلو جفت باز می باشد که همراه با هیستون های سلولی به شکل مینی کروموزوم در می آید. سازماندهی ژنومی پاپیلوماویروس ها تا حد زیادی مشابه است. یکی از ویژگی های سازماندهی ژنومی پاپیلوماویروس ها این است که همه ORF های پاپیلوماویروس ها روی یک رشته از ژنوم ویروسی قرار گرفته اند. رشته کد کننده محتوی ORF 10 قابل ترجمه می باشد که این ORF ها براساس موقعیتی که بر روی ژنوم ویروس دارند، به گروه های اولیه E و تاخیری L تقسیم بندی می شوند. البته یک ناحیه در هر یک از ژنوم های پاپیلوماویروس ها وجود دارد که ORF درآنجا وجود ندارد و به نام های مختلفی از جمله ناحیه طولانی کنترل کننده (LCR)، ناحیه تنظیمی بالا دست (URR) و ناحیه غیر کد کننده (NCR) معروف می باشد. ناحیه LCR دربین انواع پاپیلوماویروس ها از نظر موقعیت نوکلئوتیدی متفاوت است. ژنوم پاپیلوماویروس ها 8 ژن اولیه را کددهی می کند که عبارتند از E8,E7,E6,E5,E4,E3,E2,E1 که ژن E3 فقط در پاپیلوماویروس گاوی تیپ 1(BPV-1) وجود دارد. ژنهای اولیه، پروتئین هایی را که برای تکثیر و ترانسفورمیشن سلول های میزبان لازم است کد دهی می کنند و در حالتی که ویروس در مرحله تکثیر می باشد، قابل مشاهده هستند. ژنهای تاخیری، ژنهای L1 و L2 را شامل می شوند که پروتئین های ساختمانی ویروس را ایجاد می کنند و بیان آنها محدود به سلول های اپی تلیال تمایز یافته ای است که همانند سازی DNA نیز در آنها انجام می شود (71،39،38،5،1).
شکل 2-2- نقشه ژنومی در پاپیلوما ویروس
2-5- تکثیر ویروس
پاپیلوماویروس ها بسیار اختصاصی گونه هستند و تروپیسم اختصاصی به سلول های اپی تلیال اسکوآموس دارند. این ویروس ها در میزبان طبیعی خود تومورهای اپی تلیالی اسکوآموس و تومورهای فیبرو اپی تلیالی را ایجاد می کنند. عفونت پروداکتیو پاپیلوماویروس ها شامل دو مرحله اولیه و تاخیری است که با حالت تمایز سلول های اپی تلیال ارتباط دارد (71،1). سلول های بازال تنها سلول های اپی تلیالی اسکوآموس هستند که قادر به تکثیر شدن می باشند و ویروس های پاپیلوما باید این سلول ها را آلوده کنند تا بتوانند جراحت پایدار را ایجاد نمایند (1).
شکل2-3- نمایی از تکثیر پاپیلوما ویروس در ارتباط با عملکرد پروتئین های غیرساختاری
2-5-1- اتصال ورود ، پوشش برداری
اولین مرحله عفونت ویروس اتصال ویریون به گیرنده های سلولی است. مطالعات نشان داده است که پاپیلوماویروس ها علاوه برسلول های میزبان طبیعی خود( سلول های اپی تلیال سنگفرشی) می توانند به انواع زیادی از سلول های مختلف متصل شوند. بنابراین تروپیسم اختصاصی این ویروس ها به کراتینوسیت ها به دلیل وجود رسپتوراختصاصی تیپ سلول نیست. یکی از رسپتورهایی که برای اتصال و ورود پاپیلوماویروس ها استفاده می شود اینتگرین می باشد. اینتگرین را زیر واحدهای اینتگرین یعنی یا همراهی می کنند. اینتگرین در سطح بسیاری از سلول ها بیان می شود مانند، پلاکت ها، لنفوسیت ها، سلول های اندوتلیال و غیره، در حالیکه اینتگرین محدود به سلول های اپی تلیال، مزانشیمال و بعضی از سلول‌های نرونی می باشد. پاپیلوماویروس ها قدرت اتصال بیشتری برای نسبت به دارند. پاپیلوماویروس ها همچنین می توانند به هپارین و گلیکوز – آمینوگلیکان های سطح سلول های کراتینوسیت متصل شوند و به دنبال اتصال از طریق رسپتور وارد سلول شوند. ذرات ویروسی ازطریق فاگوزوم ها به داخل سلول راه می یابند که در این فرایند میکروفلامنت ها و میکروتوبول ها نیز نقش دارند. پس از ورود، فروپاشی ویریون ها درسیتوپلاسم روی می دهد (72،73،74).
2-5-2- پروموترهای ویروسی و تنظیم نسخه برداری
در ویروس HPV هفت پروموتر شناسایی شده است که شش مورد از آنها درنسخه برداری ژنهای اولیه (E) دخالت دارند و یک پروموتر تاخیری در آنها مشخص شده است (1،38). در همه پاپیلوماویروس های انسانی، مشاهده شده که یک پروموتر قبل از همه ORF ها وجود دارد. درHPV16، پروموتر P97 که در انتهای LCR3 قرار گرفته است، مسئول نسخه برداری ژنهای اولیه (E) می باشد. در HPV18 پروموتر مشابه، P105 است. در ژنوم HPV، علاوه بر LCR یک ناحیه کوتاه غیر کد کننده بین ORF های E5 و L2 وجود دارد که به علت داشتن سیگنال (A) Poly باعث اختتام نسخه برداری ژن های اولیه می شود و ژن های E و L را از هم جدا می نماید. بیشتر گونه های RNA در زگیل ها ، از جایگاه پلی آدنیلیشن Ae که در پایین دست ژن‌های Early می باشد، استفاده می کنند. گروه دوم RNA‌ها، سیگنال پلی آدنیلیشن Al را که در پایین دست ORF های L1 و L2 است، بکار می برند (1).
نسخه برداری پاپیلوماویروس ها توسط حالت تمایزی سلول های اپی تلیال اسکوآموس آلوده، تنظیم می شود. ژنوم پاپیلوماویروس ها واجد چندین عنصر تنظیمی cis است و چندین فاکتور نسخه برداری را که بیان ژن های ویروسی را تغییر می دهند، کد می کند. ناحیه LCR پاپیلوماویروس ها محتوی عناصر افزایش دهنده است که به فاکتورهای سلولی و نیز به فاکتورهای تنظیم نسخه برداری کد شده توسط ویروس پاسخ می دهند. این عناصر برای شروع بیان ژن های ویروسی بعد از عفونت ضروری هستند و ممکن است در باقی ماندن نهفتگی ویروس مهم باشند (1،38). محصولات ژن E2 در تنظیم نسخه برداری و تکثیر ویروس اهمیت دارند. پروتئین E2 با اتصال به جایگاه هایی که دربالا دست P97 و در ناحیه LCR قرار دارند از اتصال فاکتورهای سلولی TBP,SP-1 به این جایگاه ممانعت کرده و در نتیجه از نسخه برداری ژنهای E6 و E7 جلوگیری می کنند (75،76).