بررسی های آناستوموزی و تنوع ژنتیکی جدایه های R. solani عامل بیماری شانکر ساقه و شوره سیاه سیب زمینی

بررسی های آناستوموزی و تنوع ژنتیکی جدایه های R. solani عامل بیماری شانکر ساقه و شوره سیاه سیب زمینی  فهرست مطالب فهرست مطالب.. ‌ه فهرست جدول ها.. ‌ل فهرست شکل ها.. ‌م چکیده:1 فصل اول: مقدمه.. 3 کلیات.. 3 1-1-معرفی گیاه سیب زمینی و اهمیت آن.. 3 1-2-تاریخچه:.. 3 1-3-گیاه شناسی سیب زمینی.. 4 1-3-1-ریشه.. 4 1-3-2-ساقه.. 4 1-3-3-استولون.. 4 1-3-4-غده.. 5 1-3-5-جست.. 5 1-3-6-برگ.. 5 1-3-7-گل آذین.. 5 1-4- ارقام مختلف.. 5 1-4-1- رقم‌هاى خیلى ‌زودرس و زودرس.. 6 1-4-2- رقم‌هاى متوسط رس یا میان‌رس.. 6 1-4-3- رقم‌هاى دیررس.. 6 1-5-الگوی رشد.. 6 1-5-1-دوره ی قبل از سبز شدن و سبز شدن.. 6 1-5-2-رشد برگ و ساقه.. 7 1-5-3-رشد غده.. 7 1-6-ترکیبات موجود در سیب زمینی.. 7 1-7-طریقه کاشت و داشت سیب زمینی.. 7 1-8-شرایط خاک و میزان آب.. 9 1-9-شرایط اکولوژیک.. 10 1-10-خواص دارویی.. 10 1-11-اهمیت و توجیه اقتصادی سیب زمینی.. 11 1-12- بیماری های رایج.. 11 1-13-بیماری ریزوکتونیا.. 11 شکل1-1-الف: شانکر خشک ساقه ب: شوره سیاه غده (وارتون و همکاران، 2009). 12 1-13-1-علایم بیماری.. 12 1-13-2-عامل بیماری.. 13 1-13-3- مشخصات مرفولوژیک R. solani15 شکل1-2: قارچ R. solani (ویکیپدیا، 2011). 16 1-14-اهمیت اقتصادی بیماری.. 16 1-15-چرخه‌ی بیماری.. 17 شکل1-3-چرخه ی بیماری ریزوکتونیا توسط قارچR. solani((Whartonet al., 2009.. 18 1-16-روش های کنترل.. 19 1-16-1-کنترل شیمیایی.. 19 1-16-2-کنترل بیولوژیکی.. 19 1-16-3-ارقام مقاوم.. 20 1-17-ژنتیک مقاومت.. 20 1-18- انواع مقاومت.. 21 1-18-1-مقاومت عمودی.. 21 1-18-2-مقاومت افقی.. 21 1-19-تاریخچه بیماری.. 21 1-20- تحقیق.. 24 - بررسی رابطه ی نتایج داده های مولکولی و بیماری زایی جدایه ها.24 فصل دوم: مواد و روش ها.. 25 2-1-مشخصات آب و هوایی منطقه.. 25 2-2-محل اجرای آزمایشات.. 25 2-3- مشخصات خاکشناسی منطقه.. 25 2-4-ژنوتیپ های مورد آزمون.. 26 2-5- طرح آماری مورد استفاده.. 26 2-6-آماده سازی مزرعه و گلخانه برای کشت.. 26 2-6-1-تاریخ کاشت.. 26 2-6-2-عملیات کاشت.. 27 2-6-3-برداشت.. 27 2-7- جامعه ی آماری.. 27 2-8-نمونه برداری و جداسازی قارچهای عامل بیماری:.. 27 2-9-محیط کشت های لازم برای جداسازی و خالص سازی قارچ:.. 28 2-9-1- محیط کشت آب– آگار(WA) :.. 28 2-9-2- محیط کشت سیب زمینی، دکستروز، آگار (PDA):.. 28 2-9-3- محیط کشت مایع (PDB) :.. 29 2-10-خالص سازی قارچ به روش کشت مجدد:.. 29 2-11-نگهداری کشت خالص قارچ:.. 30 2-11-1- نگهداری قارچ عامل بیماری.. 30 2-12-بررسی آزمایشگاهی جدایه‌ها.. 31 2-12-1-اندازه گیری رشد شعاعی جدایه ها.. 31 2-12-2-تعیین قطر ریسه.. 31 2-12-3-رنگ آمیزی هسته.. 31 2-12-4-بررسی خصوصیات مرفولوژیکی جدایه ها.. 32 2-12-5-تعیین گروه های آناستوموزی جدایه ها.. 32 2-12-6-اثبات بیماری زایی.. 33 شکل2-1: شاخص بیماری شوره سیاه برحسب شدت و ضعف بیماری روی غده گیاه سیب‌زمینی(Anon., 1985) 34 شکل2-2-: شاخص بیماری شانکر خشک برحسب شدت و ضعف بیماری روی ساقه گیاه سیب‌زمینی.. 35 2-12-7- بررسی جدایه های Rhizoctonia از استولون های سیب زمینی و اثبات بیماری زایی آن ها بر روی گونه های گیاهی دیگر.. 35 2-13-تجزیه و تحلیل آماری.. 36 2-14-بررسی تنوع ژنتیکی جدایه ها.. 36 2-14-1-خالص کردن جدایه ها.. 37 2-14-2- تولید انبوه میسلیوم.. 37 2-14-3-استخراج DNA.. 37 2-14-4-آنالیز نتایج حاصل از RAPD.. 41 2-14-5- آزمایش PCR – RFLP برای گروه بندی رایزوکتونیا.. 41 2-14-6 الکتروفورز محصول PCR-RFLP. 42 2-14-7 الکتروفورز محصول PCR-RFLP(محصول PCRتکثیر یافته با آغازگرITS4_ITS5).. 42 فصل سوم: نتایج.. 44 3-1- بررسی های آزمایشگاهی.. 44 3-1-1- روند رشد جدایه های قارچ عامل بیماری مورد آزمون.. 44 3-1-2-تجزیه ی خوشه ای روند رشد جدایه های قارچی.. 45 شکل(3-1): دندروگرام روند رشد جدایه های قارچ عامل بیماری.. 47 3-1-3- مشاهدات رنگ کلونی قارچ عامل بیماری.. 47 3-1-4- تجزیه ی خوشه ای جدایه های رایزوکتونیا به تفکیک مشاهدات رنگ کلونی.. 48 شکل (3-2): مقایسه رنگ کلونی جدایه های قارچ عامل بیماری.. 50 3-1-5- بررسی های میکروسکوپی ناشی از اندازه گیری قطر میسلیوم ها 50 3-1-6-تجزیه ی خوشه ای جدایه های عامل بیماری شوره سیاه بر اساس قطر میسلیوم.. 51 شکل(3-3): مقایسه قطر میسلیومی جدایه های عامل شوره سیاه53 3-1-8-تجزیه ی خوشه ای جدایه های عامل بیماری شانکر رایزوکتونیایی بر اساس مقدار تولید اسکلروت.. 54 شکل(3-4): مقایسه‌ی مقدار تولید اسکلروت جدایه های قارچ عامل شانکر رایزوکتونیایی.. 56 3-2- مطالعه ی اثبات بیماریزایی جدایه ها.. 56 3-2-1- درصد آلودگی.. 57 3-2-2- تجزیه ی خوشه ای جدایه های رایزوکتونیا بر اساس درصد آلودگی.. 57 شکل(3-5): مقایسه ی درصد آلودگی جدایه های قارچ رایزوکتونیا59 3-2-3- شدت بیماری.. 60 شکل(3-6): مقایسه‌ی شدت بیماری جدایه های قارچ عامل بیماری.. 62 3-2-5- شاخص بیماری.. 63 3-2-6- تجزیه ی خوشه ای جدایه های رایزوکتونیا بر اساس شاخص آلودگی.. 63 شکل(3-7): مقایسه ی شاخص بیماری جدایه های قارچ رایزوکتونیا65 3-2-7- تجزیه ی خوشه ای جدایه های رایزوکتونیا بر اساس نمودار کلی درصد، شدت و شاخص بیماری.. 65 شکل(3-8): کلی درصد، شدت و شاخص بیماری جدایه های رایزوکتونیا66 3-2-8- بررسی ضرایب همبستگی صفات کمی و کیفی جدایه های رایزوکتونیا.. 67 3-3- بررسی نتایج آناستوموزی بین جدایه های R.solani68 3-3-1-مشخصات جدایه های R.solani AG-3.. 68 3-3-2-مشخصات جدایه های R.solani AG-4.. 68 3-3-3- مشخصات جدایه های 2-AG R.solani69 3-3-4- مشخصات جدایه های 1-1 AG R.solani69 3-4- بررسی اثبات بیماری زایی جدایه های Rhizoctonia بر روی گونه های گیاهی دیگر.. 69 3-5- بررسی تنوع ژنتیکی قارچ Rhizoctonia solani سیب زمینی با استفاده از نشانگر RAPD.. 71 شکل (3-9-الف): الگوی باندی RAPD حاصل از تکثیر جدایه های 1 تا 15 قارچ Rhizoctonia solani72 شکل (3-9-ب): الگوی باندی RAPD حاصل از تکثیر جدایه های 16 تا 30 قارچ Rhizoctonia solani73 شکل (3-10): دندروگرام بدست آمده از بررسی نتایج RAPDبا استفاده از روش UPGMA و ضریب جاکارد 74 استخراج DNA.. 75 شکل (3-11) : استخراج DNA از جدایه های مختلف رایزوکتونیاییM... 75 واکنش PCR از توالی های منطقه ITS :.. 76 آنالیز RFLP- PCR جدایه های رایزوکتونیا و گروه بندی جدایه ها 77 فصل چهارم: بحث.. 78 4- 1-بررسی های بیماری زایی جدایه ها.. 81 4-1-1- درصد آلودگی.. 81 4-1-2- شدت بیماری.. 81 4-1-3- شاخص بیماری.. 82 پیشنهادات:.. 84 پیوست ها.. 86 شکل (1)-تصاویر آلودگی غده ها ارقام مختلف سیب زمینی به بیماری شوره سیاه88 شکل (2)-تصاویر مختلف آلودگی ساقه و استولون های سیب زمینی به بیماری شانکر ریزوکتونیایی ساقه 88 شکل (3)تنوع رنگ کلونی ها ی جدایه های رایزوکتونیا89 شکل(4)مشاهده میکروسکوپی ریسه های قارچ رایزوکتونیا89 شکل(5) ایجاد واکنش آناستوموزی جدایه های رایزوکتونیا روی پرگنه. 90 شکل(6)شکل میکروسکوپی سمت راست واکنش آناستوموزی از نوع C0 و شکل سمت چپ واکنش آناستوموزی از نوع C2.. 90 شکل(7) مایه ی اینوکلوم اولیه جدایه ها برای تلقیح روی گونه های گیاهی جهت آزمایش گروه های آناستوموزی(AG). 91 شکل(8)گونه های گیاهی طالبی، چغندر، گوجه فرنگی و فلفل کاشته شده جهت اثبات آزمایش گروه های آناستوموزی(AG). 91 فهرست جدول ها جدول (2-1) میانگین وضعیت دمایی و ساعات آفتابی در منطقه در ماه های بهمن تا مرداد... 24 (ایستگاه هواشناسی استان اصفهان).. 24 جدول (2-2) نتایج تجزیه خاک مربوط به مزرعه و گلخانه. (آزمایشگاه خاک شناسی مرکز تحقیقات کشاورزی اصفهان).. 25 جدول(2-3): مقدار مواد استفاده شده برای هر واکنش PCR.. 38 جدول (2-4): چرخههای حرارتی بکار رفته در واکنش PCR.. 38 جدول(3-1): مقایسه روند رشد جدایه های قارچ عامل بیماری.. 45 جدول(3-2): مقایسه رنگ کلونی جدایه های قارچ عامل بیماری.. 48 جدول (3-3): مقایسه قطر میسلیومی جدایه های قارچ عامل بیماری 51 جدول(3-4): مقایسه ی مقدار اسکلروت جدایه های قارچ عامل شانکر رایزوکتونیایی.. 55 جدول (3-5): مقایسه ی درصد آلودگی جدایه های قارچ رایزوکتونیا 57 جدول (3-6): مقایسه ی شدت بیماری جدایه های رایزوکتونیا.. 61 جدول (3-7): مقایسه ی شاخص بیماری جدایه های قارچ عامل بیماری 64 جدول(3-9): ضرایب همبستگی صفات کمی و کیفی جدایه های رایزوکتونیایی 67 جدول (3-4-الف): اثبات بیماری زایی AG3 بر طالبی.. 70 جدول (3-4- ب): اثبات بیماری زایی AG3 بر گوجه فرنگی.. 70 جدول (3-4- ج): اثبات بیماری زایی AG3 بر چغندر.. 70 جدول (3-4-د): اثبات بیماری زایی AG3 بر فلفل.. 71 جدول پیوست: 1- جدول تجزیه واریانس اندازه کلونی روز اول.. 85 جدول پیوست: 2- جدول تجزیه واریانس اندازه کلونی روز دوم.. 85 جدول پیوست: 3- جدول تجزیه واریانس اندازه کلونی روز سوم.. 85 جدول پیوست: 4- جدول تجزیه واریانس اندازه کلونی روز چهارم.. 85 جدول پیوست: 5- جدول تجزیه واریانس رنگ کلونی.. 85 جدول پیوست: 6- جدول تجزیه واریانس مقدار اسکلروت.. 86 جدول پیوست: 7- جدول تجزیه واریانس قطر میسلیوم.. 86 جدول پیوست: 8- جدول تجزیه واریانس شدت بیماریزایی.. 86 جدول پیوست: 9- جدول تجزیه واریانس شاخص بیماریزایی.. 86 فهرست شکل ها شکل(1-1):الف: شانکر خشک ساقه ب: شوره سیاه غده (وارتون و همکاران، 2009).. 11 شکل(1-2): قارچ R. solani (ویکیپدیا، 2011).. 15 شکل(1-3):چرخه ی بیماری ریزوکتونیا توسط قارچR. solani((Whartonet al., 2009.. 17 شکل(2-1): شاخص بیماری شوره سیاه برحسب شدت و ضعف بیماری روی غده گیاه سیب‌زمینی(Anon., 1985).. 33 شکل(2-2): شاخص بیماری شانکر خشک برحسب شدت و ضعف بیماری روی ساقه گیاه سیب‌زمینی.. 34 شکل(3-1): دندروگرام روند رشد جدایه های قارچ عامل بیماری.. 47 شکل(3-2): مقایسه رنگ کلونی جدایه های قارچ عامل بیماری.. 50 شکل(3-3): مقایسه قطر میسلیومی جدایه های عامل شوره سیاه.. 53 شکل(3-4): مقایسه‌ی مقدار تولید اسکلروت جدایه های قارچ عامل شانکر رایزوکتونیایی.. 56 شکل(3-5): مقایسه ی درصد آلودگی جدایه های قارچ رایزوکتونیا.. 59 شکل(3-6): مقایسه‌ی شدت بیماری جدایه های قارچ عامل بیماری.. 62 شکل(3-7): مقایسه ی شاخص بیماری جدایه های قارچ رایزوکتونیا3 65 شکل(3-8): کلی درصد، شدت و شاخص بیماری جدایه های رایزوکتونیا 66 شکل (3-9-الف): الگوی باندی RAPD حاصل از تکثیر جدایه های 1 تا 15 قارچ Rhizoctonia solani72 شکل (3-9-الف): الگوی باندی RAPD حاصل از تکثیر جدایه های 1 تا 15 قارچ Rhizoctonia solani73 شکل (3-9-ب): الگوی باندی RAPD حاصل از تکثیر جدایه های 16 تا 30 قارچ Rhizoctonia solani73 شکل (3-10): دندروگرام بدست آمده از بررسی نتایج RAPDبا استفاده از روش UPGMA و ضریب جاکارد.. 74 شکل (3-11) : استخراج DNA از جدایه های مختلف رایزوکتونیایی.. 75 شکل (3-12) : تکثیر قطعه bp 700.≈ توسط جفت آغازگر ITS4/ITS5 از میزبان های سیب زمینی جمع آوری شده مبتلا به بیماری رایزوکتونیاM :Ladder 100 plus. 77 شکل (1)-تصاویر آلودگی غده ها ارقام مختلف سیب زمینی به بیماری شوره سیاه.. 87 شکل (2)-تصاویر مختلف آلودگی ساقه و استولون های سیب زمینی به بیماری شانکر ریزوکتونیایی ساقه.. 87 شکل (3)تنوع رنگ کلونی ها ی جدایه های رایزوکتونیا.. 88 شکل(4)مشاهده میکروسکوپی ریسه های قارچ رایزوکتونیا.. 88 شکل(5) ایجاد واکنش آناستوموزی جدایه های رایزوکتونیا روی پرگنه 89 شکل(6)شکل میکروسکوپی سمت راست واکنش آناستوموزی از نوع C0 و شکل سمت چپ واکنش آناستوموزی از نوع C2.. 89 شکل(7) مایه ی اینوکلوم اولیه جدایه ها برای تلقیح روی گونه های گیاهی جهت آزمایش گروه های آناستوموزی(AG).. 90 شکل(8)گونه های گیاهی طالبی، چغندر، گوجه فرنگی و فلفل کاشته شده جهت اثبات آزمایش گروه های آناستوموزی(AG).. 90 چکیده: سیب زمینی با نام علمی(L.tuberosum(Solanumبا سطح زیر کشت 18 میلیون هکتار پس از گندم، جو و برنج از مهم ترین محصولات کشاورزی در جیره ی غذایی به شمار می رود. بر اساس آمار منتشره، سطح زیر کشت سیب زمینی در ایران 173 هزار هکتار و میزان تولید آن 21/4 میلیون تن در سال برآورد شده است. هم اکنون، بیماری ریزوکتونیا در اثر solaniRhizoctoniaاز بیمار ی های مهم مزارع سیب زمینی کشور است که با علایم شانکر خشک و شوره سیاه ظاهر می شود و موجب کور شدن استولن ها می گردد. لذا، محصول را به شدت کاهش می دهد. به منظوربررسی ویژگی­های فنولوژیکی، مورفولوژیکی، آناستوموزی و هم چنین بیماری­زایی جدایه­هایR.solani ، 300 نمونه­ی آلودهاز مناطق مهم سیب­زمینی کاری کشور شامل استان­های همدان، اردبیل، فارس، اصفهان، کردستان و کرمان جمع­آوری، جداسازی و خالص سازی شد، روند رشد جدایه­ها روی محیط کشت­PDA، تفاوت در رنگ کلنی­ جدایه­ها، تعیین قطر ریسه ها و میزان تولید اسکلروت بررسی گردید. بررسی ها از نظر بیماری­زایی جدایه­ها روی گیاه سیب­زمینی، رقم مارفونا در شرایط گلخانه مورد مقایسه قرار گرفت. با توجه به اهمیت موضوع بررسی هایی نیزدر خصوص تفاوت جدایه ها در تنوع ژنتیکیجدایه ها با استفاده از روش های مولکولی RAPD و PCR-RFLP انجام گردید. برای تعیین گروه های آناستوموزی از نظر ژنتیکی در این مناطق، با استفاده از واکنش زنجیره ای PCR از منطقه ITS ، آلودگی تعدادی از آن ها به بیماری رایزوکتونیا تایید شد. سپس منطقه ی تکثیر شده با آنزیم هایی مانند TaqI ,EcoRI ,AluI و چند آنزیم برشی دیگر مورد هضم آنزیمی قرار گرفت. براساس مقایسه ی الگوی برش آنزیمی، جدایه ها به چندگروه تقسیم شدند. بررسی­های آزمایشگاهی نشان داد که در محیط کشت PDA بیشترین میزان رشد متعلق به اصفهان 1 و کمترین مربوط به نمین 8 و اسدآباد 1 بوده است. رنگ کلنی­ جدایه­ها از کرم تا قهوه­ای تیره متفاوت بوده که شاخص موبوطه اثر معنی­دار داشت. هم­چنین، مشخص گردید که بیش ترین میزان تولید اسکلروت به ترتیب مربوط به سنندج 2 و کم ترین میزان متعلق به جیرفت 3، اقلید 4 و 5، آباده 1، کازرون 3، رزن 2، گلپایگان 2، سمیرم 3 و4 و اصفهان 1می­باشد. اندازه گیری قطر میسلیوم نشان داد که جدایه ی روستای نیاز(اردبیل) دارای بیشترین قطر و جدایه های سمیرم 3، گلپایگان 2 و اقلید 5 دارای کمترین قطر می باشند. بررسی شاخص­ بیماری­زایی جدایه­ها نیز تفاوت­های قابل توجه با اثری معنی­دار را نشان داد بدین ترتیب که بیشترین شدت بیماری متعلق به جیرفت 5 (86.1) و اصفهان 5 (80.55) و کمترین شدت بیماری متعلق به سمیرم 4 (15) و رزن 2 (33.3) اختصاص داده شد.مقایسه توالی های نوکلئوتیدی این جدایه ها با جدایه های موجود در بانک ژن نشان داد که جدایه های مرتبط به میزان 99% با توالی های ثبت شده مرتبط با رایزوکتونیا مشابهت دارند وبر مبنای واکنش های انجام شده جدایه های جمع آوری شده در چهار گروه آناستوموزی AG3، AG4، AG2، AG1 گروه بندی شدند. گروه غالب در میان جدایه های مورد بررسی، گروه آناستوموزی AG3 با 83.3٪بود. واژه‌های کلیدی:سیب زمینی،ریزوکتونیا،جدایه،آناستوموزی، ژنتیک،RAPD،RFLP، فنولوژیکی، مورفولوژیکی، اصفهان فصل اول: مقدمه کلیات 1-1-معرفی گیاه سیب زمینی و اهمیت آن سیب زمینی (Solanum tuberosum L.) محصول غذایی پراهمیتی است که به دلیل سازگاری با شرایط محیطی متفاوت، پتانسیل باقی ماندن برای نسل ها را با توجه به افزایش جمعیت جهان داراست. سیب‌زمینی از نظر مقدار تولید، چهارمین محصول جهان پس از گندم، برنج و ذرت می باشد Anon, 1985)). این محصول در ناحیه ای از کوه های آند واقع در آمریکای جنوبی کشف شده است. ساکنین این منطقه به گواهی باستان شناسان، هفت هزار سال پیش این گیاه را کشت و از ریشه ی مغذی آن به عنوان غذا استفاده می کردند. این محصول پرارزش حدود 250 سال بعد از رواج آن در اروپا، در زمان فتحعلی شاه قاجار وارد ایران شد (حیدرنیا، 1365). تحقیقات سیب زمینی در ایران از سال 1339 با وارد نمودن ارقام مختلف از کشورهای هلند، آلمان و انگلستان شروع گردید. براساس رده‌بندی Cronquist سیب‌زمینی در فرمانرو گیاهان، شاخه‌ی Angiosperms زیرشاخه‌ی Magnoliophyta رده‌ی Magnoliopsida زیر رده‌ی Asteridae، راسته‌ی Solanales، تیره‌ی Solonaceae، جنس Solanum، گونه‌ی tuberosumبا نام علمی tuberosum Solanum می‌باشد(,Cronquist 1988). از خانواده یSolanaceae ، فقط گونه ی Solanum tuberosum در سطح جهان کشت می گردد و بقیه ی گونه های آن محدود به کوه های آند واقع در آمریکای جنوبی می باشد که در این مناطق گونه های وحشی از آن یافت می شود. تغییرات جوی اخیر در دنیا گونه های وحشی سیب زمینی را در معرض خطر نابودی قرار داده است و تهدیدی جدی بر علیه منابع ژنتیکی ارزشمند در مقابله با آفات گیاهی و مقاومت در برابر خشکسالی به شمار می آید. چرا که عوامل ژنتیکی یافت شده در گونه های وحشی منجر به تولید انواع جدیدی از سیب زمینی های غیر وحشی و مقاوم می شود که مقاومت این گیاه را در برابر عوامل آسیب رسان افزایش می دهد، طی پیش بینی کارشناسان در 50 سال آینده بیش از 60درصد از این گونه ها منقرض خواهند شد. 1-2-تاریخچه: دانشمندان آمریکایی دریافته‌اند که سرمنشأ کلیه انواع سیب زمینی‌های امروزی را می‌توان در یک گیاه واحد که بیش از هفت هزار سال قبل در کشور پرورشد می کرده ردگیری کرد (Sinkovec and Magdalena, 2004). سیب­زمینی در حوالی سال 1570 توسط فاتحان اسپانیایی از آمریکای جنوبی به آن کشور منتقل شد و کشت آن در سراسر اروپا رواج یافت. سیب زمینی بعداً توسط مستعمره نشین‌های بریتانیایی به آمریکای شمالی منتقل شد(Hijmans, 2001). براساس آمار و اسناد قدیمی ‌تاریخ ورود این گیاه به ایران به عهد قاجاریه می‌رسد(Laufer,1938). بعدازآناطلاعاتیدرارتباطباچگونگیورود،انتقالوگسترشآندرسطحکشوردردستنیست تااینکهارقامپشندیواستانبولیدرسطحنسبتازیادیدرمناطقکوهستانیشمالکشورکشت و کار شده است (George,1978).ازسالهای1340توسعهکشتسیبزمینیدرمناطقمختلفکشورشروعشدهودردهه50دراغلباستانهاومناطق،تولیدآنتوسعهیافتهاستوبهعنوانسومین محصولبعدازگندموبرنجدرتامیننشاستهموردنیازدرتغذیهمردمایرانقراردارد(مجیدی و داوودی، 1382). 1-3-گیاه شناسی سیب زمینی سیب زمینی گیاهی یک ساله از گیاهان عالی گلدار و از رده دولپه ای ها است. در ذیل بخش های مختلف آن به اختصار توضیح داده می شود. 1-3-1-ریشه بوته های رشد یافته از بذرهای حقیقی، یک ریشه راست و باریک توسعه می دهند. که از آن، انشعابات جانبی به وجود می آید. بوته های رشد یافته از غده در گره های ساقه زیر زمینی و استولون، تولید ریشه نابجا می کنند. در سیب زمینی، ریشه ها عموماً کم عمق هستند (اغلب 40 تا 50 سانتی متر) 1-3-2-ساقه سیستم ساقه در سیب‌زمینی شامل ساقه، استولون و غده می‌باشد. ساقه معمولا سبز، نسبتاً کلفت (به قطر تقریبی 5/2-2 سانتی متر) منشعب و کمی زاویه دار است (طباطبایی، 1365). 1-3-3-استولون استولون‌ها، ساقه‌های جانبی هستند که به طور افقی از جوانه‌های موجود روی بخش زیرزمینی ساقه شکل می‌گیرند (Dclorit & Greub, 1984)، طول آن ها متغیر بوده به طوری که به عنوان پارامتر مشخص کننده‌یرقم به شمار می‌روند. در اثر حجیم شدن انتهای استولون‌ها غده تشکیل می‌شود، ولی همه‌ی استولون‌ها تشکیل غده نمی‌دهند. 1-3-4-غده غده، ساقه‌ی تغییر شکل یافته است که عضو اصلی ذخیره در گیاه می باشد(Kipps, 1970). اندازه ی غده متناسب با نوع واریته، شرایط خاک و اقلیم است و دارای اشکال گرد، بیضی و یا تخم مرغی شکل هستند. پوست غده به رنگ های زرد، نارنجی، قرمز، ارغوانی و کرم دیده می شود. 1-3-5-جست با رشد جوانه‌ها در چشم‌های غده ی سیب‌زمینی، جست‌ها تشکیل می‌شوند. در شرایط مساعد جست‌ها سریعاً رشد کرده و ساقه و ریشه ی اصلی را تولید می‌کنند. رنگ‌های مختلف جست‌ها در شناسایی ارقام مختلف سیب‌زمینی اهمیت دارند (طباطبایی، 1365). 1-3-6-برگ برگ ها مرکب یک بارشانه ای و فرو شانه ای است یعنی در انتهای دمبرگ اصلی هم یک برگچه دیده می شود که با فیلوتاکسی مارپیچی روی ساقه آرایش یافته اند. دمبرگ اصلی علفی و معمولا کمی خمیده و به رنگ سبز روشن است که در روی آن 7-9 برگچه قرار گرفته است. 1-3-7-گل آذین سیب زمینی دارای گل‌آذین گرزن و گل‌های دو جنسی، سفید مایل به بنفش است (Jones & Luchsinger, 1987). گل ها خوشه ای دیهیم، نسبتاً درشت، پیوسته گلبرگ و دارای 5 کاسبرگ و5 گلبرگ می باشند. پرچم ها کوتاه و به هم چسبیده، 5 عدد، دارای بساک زرد مشخص در دور مادگی، مادگی دارای 5 برچه به هم چسبیده می باشد. میوه ی آن سته کوچک به قطر چند میلی متر، ابتدا سبز، و بعد به تدریج تیره و سیاه یا زرد می شود. در سیب زمینی بعضی ارقام به دلیل نر عقیمی بذر تولید نمی کنند. به طور کلی عقیمی دانه ی گرده به وفور دیده می شود. بذر تولید شده به دلیل هتروزیگوسیتی شدید در زراعت مورد استفاده قرار نمی گیرد و فقط در اصلاح نباتات کاربرد دارد. 1-4- ارقام مختلف این گیاه دارایارقام مختلفی است که آنها را به زودرس، دیررس و میانه‌رس تقسیم می‌­کند: 1-4-1- رقم‌هاى خیلى ‌زودرس و زودرس دوره کامل براى رشد و تولید غده در رقم­‌هاى خیلى‌زودرس ۷۰ تا ۸۰ روز و در رقم­‌هاى زودرس ۸۰ تا ۹۰ روز است. عملکرد این ارقام در مقایسه با رقم‌هاى دیررس کم­‌تر است که به‌علت بالا بودن درصد آب در غده، کم بودن ماده خشک و نازکى پوست غده، قابل ذخیره به‌صورت انبارى نیست و باید تازه مصرف شود. این رقم‌ها به سیب‌زمینى بهاره معروف هستند. مارفونا، سینورا، فونتانه، اوشینا و ناتاشا از ارقام بهاره رایج در ایران است (حسن پناه و حسن آبادی،1389). 1-4-2- رقم­‌هاى متوسط رس یا میان‌رس در این رقم‌ها زمان لازم براى رسیدن و تولید غده ۱۰۰ تا ۱۲۰ روز است و به‌ارقام تابستانه معروف هستند. ساتینا، مارکیز و آرکونا از ارقام رایج میان رس کشت شده در ایران است(حسن پناه و حسن آبادی،1389). 1-4-3- رقم­‌هاى دیررس زمان لازم براى رشد کامل و تولید محصول در این رقم­‌ها ۱۳۰ تا ۱۵۰ روز است و به‌رقم­‌ها دیررس پائیزه معروف هستند. عملکرد محصول و مقدار نشاسته در رقم­‌هاى دیررس بیش از رقم‌هاى متوسط رس و زودرس است و خاصیت آنها براى نگهدارى در انبار بیشتر است که ارقام پاییزه رایج در ایران شامل آگریا، مارفونا، بورن، فانته، ساتینا، مارل، آلمرا، بانبا، ساوالان و کایزر است(حسن پناه و حسن آبادی،1389). در کشور ما اکنون رقم‌هاى گوناگونى مورد آزمایش و بررسى قرار گرفته که با توجه به‌ مجموعه شرایط، ارقام زیر با ویژگى‌هاى گوناگونانتخاب شده‌اندآگریا، مارفونا، سانته، پشندی، آئولا، دراگا، کوزیما، مورن و دیامونترقم­‌هائى هستند که براى کشت در سطوح وسیع در نواحى گوناگونانتخاب شده‌اند(جعفرپور، 1370). 1-5-الگوی رشد الگوی رشد (رشد شاخ و برگ، رشد استولون و غده) تحت تاثیر دما، طول روز، شدت نور، سن فیزیولوژیک غده ی بذری، تراکم گیاهی، میزان ازت و میزان رطوبت است. سیب زمینی الگوی رشد خاصی دارد. سه دوره ی مهم در چرخه ی رشد این گیاه، قابل شناسایی است. 1-5-1-دوره ی قبل از سبز شدن و سبز شدن طول دوره ی کاشت تا سبز شدن به میزان خواب جوانه های موجود روی غده، دما و رطوبت خاک، عمق کاشت و روش کاشت، هم چنین بافت و ساختمان خاک بستگی داشته و غالبا 3 تا 4 هفته می باشد. 1-5-2-رشد برگ و ساقه رشد رویشی از سبز شدن آغاز شده و با شروع غده بندی به اتمام می رسد. طی این دوره برگ ها و ساقه ها در هوا و ریشه ها و استولون ها در زیر خاک رشد می کنند. بعد از سبز شدن، شاخ و برگ ریشه به طور هم زمان توسعه می یابند. رشد شاخ و برگ و رشد ریشه با یکدیگر همبستگی دارند. 1-5-3-رشد غده رشد غده ممکن است، در حدود 2 الی 4 هفته بعداز سبز شدن به آرامی شروع شود و با میزان ثابت در طول دوره ی نسبتا طولانی ادامه داشته باشد. دوره ی رشد غده در حدود 60 تا 90 روز به طول می انجامد. زمان شروع غده بندی تحت تاثیر میزان انتقال مواد غذایی به سمت ریشه قرار دارد. اما معمولا هنگامی که ارتفاع بوته (از سطح خاک تا راس و مریستم انتهایی) به 15 تا 20 سانتی متر می رسد شروع می شود. 1-6-ترکیبات موجود در سیب زمینی سیب­زمینی سرشار از بتاکاروتن (پیش­ساز ویتامین A است که پس از پخته ­‌شدن به آسانی جذب می­‌شود. ساقه و برگ‌های سیب­زمینی حاوی سمی بنام سولانین است که نباید آن را مصرف کرد.سیب­زمینی به خصوص تازه و پوست نکنده آن حاوی مقادیری پروتئین و ویتامین به خصوص ویتامینC است. سیب­زمینی اگر برای مدتی طولانی انبار شده یا برای مصرف پوست کنده شده باشد تا حدودی خواص غذایی خود را از دست می‌دهد. ویتامین C یک آنتی اکسیدان است و به تولید پروتئینی به نام «کولاژن» که تشکیل­دهنده استخوان، غضروفمفاصل، عضلات و رگ‌های خونی است کمک می‌کند.سیب­زمینی علاوه بر ویتامین C حاوی مواد مفید دیگری مثل پتاسیم، فسفر، آهن و منیزیم است. سیب­زمینی همچنین حاوی مقدار زیادی ویتامین Bاست.مهم­‌ترین ماده اصلی موجود در سیب­زمینی نشاسته‌(کربوهیدرات) است که معمولاً ۹ تا ۲۵ درصد آن را تشکیل می­دهدو همچنین دارای مقداری مواد معدنی مانند پتاسیم و کلسیم است.(Englyst etal., 1992) 1-7-طریقه کاشت و داشت سیب زمینی کشاورزان در صورت فراهم شدن امکانات و به‌ویژه در زمین­‌هاى داراى بافت سنگین، در پائیز یا زمستان و نیز چند ماه قبل از کاشت غده، زمین را به‌عمق حدود ۳۰ سانتى‌متر شخم مى­‌زنند. در چنین حالتى در زمان کاشت که بسته به‌زمان برداشت محصول (بهاره یا پائیزه) تفاوت مى­‌کند، زمین را دیسک مى­‌زنند و آن را براى کاشت آماده مى­‌کنند. در کشتزارهاى بزرگ سیب­‌زمینى که عموماً واقع در دشت­‌ها است بیشتر عملیات آماده کردن زمین با ماشین انجام مى­‌شود. در نقاط کوهستانى که وسعت کشت‌زارها کم است، عملیات آماده کردن زمین با استفاده از دام انجام مى‌­شود.در زمین­‌هاى سبک و براى کشاورزانى که امکان شخم در پائیز یا زمستان را ندارند، پیش از کاشت و با استفاده از رطوبت موجود زمین، آنرا شخم مى­‌زنند. پس از عمل شخم، دیسک زده مى­‌شود و زمین براى کاشت سیب‌زمینى آماده مى­‌گردد. کاشت به دو صورت دستى و ماشینى انجام مى­‌گیرد. کاشت دستى معمولاً در زمین­‌هاى کوچک و متوسط و کاشت ماشینى در زمین­‌هاى بزرگ و هموار واقع در دشت­ها انجام مى­‌شود. در کاشت دستى سیب­‌زمینى­‌هاى کامل یا بریده شده را با دست و در فاصله­‌اى که از پیش در نظر گرفته­‌اند در جویچه­‌هاى آماده شده مى­‌ریزند. سپس به‌وسیله گاوآهن و یا استفاده از خیش­‌هاى خاک برگردان روى غده­‌ها را با خاک مى­‌پوشانند. معمولاً تراکتور را طورى هدایت مى­‌کنند که لاستیکها بین پشته­‌ها حرکت نموده و سیب­‌زمینى­‌ها آسیب نبینند. به این‌ترتیب خاک، روى غده­‌ها را مى­‌پوشاند و پشته­‌هایی تشکیل مى­‌شوند. در شیوه ماشینی، کشت سیب­‌زمینى به‌وسیله ماشین­‌هاى غده‌کار یک یا دو ردیفى انجام مى­‌شود. تنظیم عمق کاشت، فاصله بوته­‌ها روى ردیف و فاصله ردیف­‌هاى کاشت، با تنظیم بذر کار انجام مى­‌شود. دستگاه سیب­‌زمینى کار ابتدا شیارى ایجاد مى­‌کند که غده‌هاى سیب‌زمینى از درون مخزن به فاصله مورد نظردرون این شیار­ها مى­‌افتند و خاک برگردان ماشین روی سیب­‌زمینى‌ها را مى­‌پوشاند. درکاشت دستى فاصله بوته­‌ها روى ردیف ۲۵تا۳۰سانتیمتر و فاصله ردیف‌ها ۵۰ تا ۶۰ سانتیمتر است.در کاشت ماشینى فاصله ردیف‌ها ۷۵ سانتی‌متر و فاصله بوته­‌ها روى ردیف‌ها ۲۵ سانتی‌متر در نظر گرفته مى­‌شود. به‌ این‌ترتیب تعداد بوته در هکتار ۵۵-۵۰ هزار عدد خواهد بود.در کاشت غده تنها براى حدود ۴ درصد سطح زیرکشت که متعلق به ۵/۲ درصد بهره‌برداران است از ماشین کمک گرفته‌اند (به‌نظر مى­‌رسددر واقعیت نیاز به کاربرد ماشین براى کاشت بیشتر از این مقدار باشد).زمان کاشت براى سیب­‌زمینى­‌هائى که اواخر تابستان و اوایل پائیز برداشت مى­‌شوند، با توجه به شرایط آب و هوایى از نیمه فروردین آغاز و تا نیمه خرداد ادامه مى­‌یابد. نزدیک به ۸۵ درصد سیب‌زمینى کشور مربوط به این زمان کشت است و مهم­‌ترین مناطق آن عبارتند از:اردبیل، فریدناصفهان، همدان، شاهرود، تبریز. براى محصولى که در اواخربهار و اوایل تابستان برداشت مى­‌شود زمان کاشت از اواخر پائیز تا زمستان است ومهم­‌ترین مناطق کشت آنعبارت است از: دزفول، جیرفت، هرمزگان (حاجى‌آباد)، گرگان و حومه اصفهان. البته امروزه با در اختیار قرار گرفتن ارقام زود رس، در مناطقی همانند بهار استان همدان نیز کشت در اوایل بهار انجام شده و برداشت در اوایل تابستان انجام می­شود. سیب‌زمینی با کشت بذر حقیقیو یا توسط غده‌های بذری تکثیر می‌یابد. در حالت دوم می‌توان غده را به چند قسمت تقسیم نمود، ولی باید هر قسمت دارای حداقل یک جوانه ی سالم باشد. پس از کاشت، از هر جوانه یک ساقه هوایی ظاهر می‌گردد. فاصله ی ردیف‌ها در کشت حدود 90-70 سانتی‌متر است که در نواحی خشک این فاصله افزایش یافته و در نواحی مرطوب فاصله کمتر انتخاب می‌شود. فاصله ی بین غده‌ها در روی ردیف‌ها (پشته‌ها) از 45-15 سانتی‌متر تغییر می‌کند. عمق کاشت غده تحت تاثیر عوامل متعدد مثل زمان کاشت، نوع خاک و شرایط آب و هوایی تغییر می‌کند. معمولا غدد بذری را در عمق 10 سانتی‌متر می‌کارند (Schmiediche et al., 1986). 1-8-شرایط خاک و میزان آب خاک های مناسب برای زراعت سیب زمینی بایستی دارای تداخل بالا و تهویه خوب با بافت شنی- رسی باشد. خاک های سبک متوسط عملکرد را بالا برده و تولید غده های درشت تر می نماید. شوری خاک باعث کوتاه ماندن طول بوته می گردد. به طور کلی سیب زمینی جزو گیاهان نیمه مقاوم به شوری است. گیاه سیب زمینی به PH خاک عکس العمل های مختلفی نشان می دهد. مثلاً در PH بالاتر از 7 میزان محصول کم و در PH حدود 5/6- 5/5 میزان عملکرد بالا و غده های درشت تر خواهد بود. بسیارى از کشاورزان از زمان کاشت تا زمان سبز شدن غده‌هاى سیب‌زمینى مزرعه را آبیارى نمى­‌کنند.این دسته از کشاورزان به اتکاء رطوبت موجود در خاک و ذخیره آب غده سیب­‌زمینی، این‌گونه عمل مى­‌کنند. در چنین حالتى خاک خشک، آب غده‌ها را مى­‌کشد و در نتیجه ریشه کوتاه و قدرت غده‌دهى‌ کم مى­‌شود. برخى از کشاورزان نیز پس از کاشت و بلافاصله مزرعه راآبیارى مى­‌کنند. آب مورد نظر گیاه بسته به شرایط آب و هوائى منطقه، فصل کاشت و نوع خاک تفاوت مى‌­کند. معمولاً تا زمان سبز شدن و یا بلافاصله پس از آن یک نوبت آب مى­‌دهند، از این پس آبیارى به‌طور منظم انجام مى­‌شودو نوبت‌هاى اول تا سوم آبیارى که گیاه کوچک ‌تر و هوا خنک- ‌تر است هر ۹ تا ۱۰ روز یک بار می باشد. فاصله آبیارى در نوبت­‌هاى چهارم و پنجم به حدود ۸ تا ۹ روز مى­‌رسدکه به‌تدریج که گیاه پرشاخ و برگ مى­‌شود و هوا نیز رو به گرمى مى­‌رود، تعریق و تبخیر افزایش مى­‌یابد در نتیجه فاصله دوره آبیارى کوتاه‌تر مى­‌گردد و در آبیارى­‌هاى ششم و هفتم به هفته­‌اى یک‌بار مى­‌رسد. در ماه مرداد که معمولاً هوا گرم­‌تر است و گیاه در دوره گل­‌دهى و تشکیل غده به‌سر مى­‌برد نیاز آبى بالاتر رفته و فاصله نوبت­‌هاى آبیارى به ۵ تا ۶ روز مى­‌رسد. از شهریور ماه دوباره مصرف آب کاهش مى­‌یابد و فاصله‌ها زیادترمى­‌شود و بسته به‌نوع بذر از حدود ۱۰ روز قبل از برداشت آبیارى قطع مى گردد.در مناطق سردسیر که در تابستان باران مى­‌بارد با توجه به‌مقدار و تعداد دفعات بارندگى از نوبت و میزان آبیارى کم مى‌­شود. به‌طور کلى در مناطق مختلف نیاز آبی آن حدود 5600تا 8400 متر مکعب است که بسته به اقلیم و تیپ رشد به وسیله باران و 2 تا 8 بار آبیاری تکمیلی تامین می شود (معتمد، 1374). 1-9-شرایط اکولوژیک سیب زمینی از لحاظ اکولوژی خاصیت انعطاف زیادی دارد و از حدود دایره ی قطبی تا نواحی استوایی کاشته می شود، اما در آب و هوای سرد و خشک بهترین رشد را دارد، به همین دلیل بهترین نقاط رویش طبیعی این گیاه مناطق کوهستانی می باشد. جوانه های جوان سیب زمینی بهترین توسعه را در حرارت 19-13 درجه ی سانتی گراد خاک دارا هستند. سیب زمینی یخبندان جزیی در شب را تحمل می نماید و نقطه ی انجماد آن 3- درجه ی سانتی گراد و کمترین درجه حرارت برای ذخیره شدن مواد غذایی در غده 2 درجه ی سانتی گراد می باشد (جانیک[1]، 1986). 1-10-خواص دارویی این سبزی نشاسته ای با دارا بودن مقادیر بسیار زیادی از ویتامین های گروه B، Cو 15 ماده معدنی مختلف خواص درمانی متفاوتی دارد که از آن همه می توان به نقش آن در کاهش فشار خون، تقویت هوش و حافظه در کودکان، دفع سموم بدن، تقویت قلب و استحکام لثه ها اشاره کرد. هم چنین سیب زمینی حاوی آنزیم هایی است که برای التیام زخم های معده بسیار مفید است. تحقیقات جدید نشان می دهد که پودر ساخته شده از سیب زمینی معمولی می تواند خون را منعقد کند و بریدگی های کوچک را ببندد. آب سیب زمینی خام در نسخه های سنتی برای درمان مشکلات گوارشی- سوءهاضمه، کولیت، زخم های جهاز هاضمه، اختلالات کبدی، سنگ کیسه صفرا، یبوست و به عنوان یک آنتی اسید تجویز می شود. همچنین، سیب زمینی حاوی نوعی مواد شیمیایی است که می تواند در از میان بردن سلول های سرطانی و بعضی ازویروس ها موثر باشد .پوست سیب زمینی دارای مواد آنتی اکسیدانی است کهقادر به خنثی کردن عملکرد رادیکال های آزاد مخرب در بسیاری از بیماری ها می باشد و ازاین رو می تواند روند پیری را نیز کند نماید.سیب زمینی برای اشخاصی که مبتلا به قند هستند مضر است(حیدر نیا، 1365). 1-11-اهمیت و توجیه اقتصادی سیب زمینی گیاه سیب‌زمینی از جمله محصولات زراعی مهمی است که پس از ذرت، دارای بیشترین سطح زیر کشت در جهان می‌باشد. این محصول از نظر غذایی در جیره‌ی روزانه مردم ایران پس از گندم و برنج از سرانه‌ی مصرف بالایی برخوردار است و در 140 کشور جهان کشت می‌شود که اکثر آن ها در مناطق گرمسیری و نیمه گرمسیری واقع شده است. طبق گزارشات فائو چین بالاترین رکورد تولید سیب­زمینی رادر سال 2009 در جهان دارد و بعد از آن به ترتیب روسیه و هند در مقام های دوم و سوم قرار دارند و آمریکا در مقام چهارم ایستاده است. فائو اعلام کرده است که ایران در مقام چهاردهم از نظر تولید سیب زمینی در جهان و مقام دوم خاور میانه می باشد(FAO, 2009). تولید جهانی سیب‌زمینی 327 میلیون تن در سال می‌باشد که در ایران تولید 21/4 میلیون تن در سال برآورد شده است. سطح زیر کشت سیب‌زمینی در جهان و ایران به ترتیب 18 میلیون هکتار و 173 هزار هکتار می‌باشد. میزان بالاترین سطح زیر کشت در جهان و ایران به ترتیب مربوط به چین و اردبیل می‌باشد. 1-12- بیماری های رایج سیب زمینی نیز مانند سایر محصولات زراعی دیگر مورد حمله ی بسیاری از عوامل بیماریزا از جمله باکتری ها، قارچ ها، ویروس ها، ویروییدها، فیتوپلاسماها، نماتدها و حشرات قرارمی گیرد و حتی دستخوش شرایط نامساعد محیطی و کمبودها نیز می شود که در کل باعث کاهش تولید، یا فساد غده ها می گردد و فاکتورهای کمی و کیفی سیب زمینی را تحت تاثیر قرار داده و به مخاطره می اندازد. از بیماری های شاخص قارچی سیب زمینی می توان پوسیدگی خشک، پژمردگی فوزاریومی، پوسیدگی صورتی، لکه نقره ای، پژمردگی ورتیسلیومی و لکه موجی را نام برد. 1-13-بیماری ریزوکتونیا بیماری پوسیدگی ریشه ی سیب زمینی، شانکر ریزوکتونیایی و نیز شوره سیاه ( Rhizoctonia or Black scurf) یکی از مهمترین بیماری های سیب زمینی بوده که انتشار جهانی دارد. عامل بیماری در مرحله ی غیر جنسی قارچ Rhizoctonia solani Kuehn است و در مرحله ی جنسی DonkThanatephorus cucumeris (Frank) می باشد که روی بسیاری از گیاهان و علف های هرز از جمله پنبه، کلم، بقولات، دانه های روغنی و غیره ایجاد بیماری می کند و سبب مرگ گیاهچه و شانکر طوقه می گردد((Cubeta, 2000. الف ب شکل1-1-الف: شانکر خشک ساقه ب: شوره سیاه غده (وارتون و همکاران[2]، 2009) 1-13-1-علایم بیماری شوره سیاه، آشکارترین علامت بیماری توسط این قارچ عامل بیماری است که منجر به تشکیل توده های سخت یا همان اسکلروت بر روی غده می شود (شکل 1-1).اسکلروت ها اشکال نامنظم، فاقد اندازه ی مشخص و زگیل مانند هستند و در انبار به غده نفوذ نمی کنند، ولی اگر به عنوان غده ی بذری استفاده شوند در سطح مزرعه روی گیاه ایجاد آلودگی می نمایند ((Loria et al., 1993. اوایل فصل قارچ بیمارگر به جوانه های در حال رشد زیر خاک حمله می کند، قبل از آن که آن ها سر از خاک در بیاورند. اگر آلودگی در راس گیاهچه باشد، ممکن است جوانه ها از بین بروند، در نتیجه ظهور با تاخیر و نیز ناهماهنگی کلن ها در رشد و فقر گیاهی خواهد بود. انرژی غده ی بذری صرف تولید مجدد جوانه ها می شود و تولید محصول کاهش خواهد یافت. غده های بذری به شدت آسیب دیده نمی توانند گیاهی روی سطح زمین تولید کنند. در عوض، استولون با غده های کوچک متعدد تولید می کنند (Osborn, 1995; Johnson, 2007). قبل از سبز شدن گیاهچه ها، قارچ ایجاد شانکر فرورفته قهوه ای روی ریشه و ساقه های زیر زمینی نموده و باعث قطع و افتادن گیاه جوان می شود. ولی بعد از این که گیاهان به 15 سانتی متر رسیدند حالت فوق پیش نمی آید و قارچ با ایجاد شانکر روی ساقه ی زیر زمینی مشخص می شود که کمتر مرگ گیاه را باعث می شود. مهم ترین خسارت در این مرحله، ایجاد شانکرهای عمیق و قطع استولون ها و عدم توسعه و رسیدن غده های جوان می باشد. در گیاهان مسن ممکن است پیچیدگی برگ ها، زردی و پژمردگی انتهای ارغوانی بوته ها مشاهده گردد(Schwartch & Gent, 2005) . فصل بعد، آسیب گیاه از شانکر ساقه و استولون به دلیل مشکل در جابه جایی نشاسته است. اگر استولون ها و ساقه های زیر زمینی به شدت توسط ریزوکتونیا آلوده شوند، نمی توانند نشاسته تولید شده در برگ ها را برای توسعه ی غده ها انتقال دهند. در این صورت، غده های سبز کوچک که غده های هوایی نامیده می شوند، روی ساقه ی هوایی تشکیل می گردد. تشکیل غده ی هوایی می تواند نشانه ی این باشد که گیاه غده بازارپسند مطلوبی، در زیر خاک ندارد. در پایان فصل رشد، قارچ حالت جنسی(تلمورف) Thanatephorus cucumerisرا فقط روی ساقه بالای سطح خاک تولید می کند. تلمورف به صورت یک لایه ی نازک سفید سطحی می باشد که به آسانی برداشته می شود ((Loria et al.,1993. شانکر می تواند با محدود کردن حرکت آب و مواد غذایی داخل گیاه قابلیت باروری گیاه را به صورت کمی و کیفی کاهش دهد. علایم هوایی، مانند تشکیل غده های هوایی و برگ های مایل به ارغوانی در مواقعی که گیاه به شدت آلوده شده است، مشاهده می گردد .(Cubeta & Cody, 1998) دیگرعلایم بیماری عبارتند از: - تغییر شکل غده ها، تورفتگی و شکاف روی غده - از بین رفتن چشم های غده و ساقه ی جوان -کاهش سطح سبز مزرعه، تعداد ساقه، تعداد غدد، عملکرد 1-13-2-عامل بیماری رده بندی قارچ Rhizoctonia solani به شرح روبرو می باشد. Kindom: Fungi Phylum: Basidiomycota Class: Basidiomycetes Subclass: Agaricomycetidas Order: Polyporales Family: Corticiaceae Genus: Rhizoctonia Species: R. solani رده بندی Thanatephorus cucumeris به شرح روبرو می باشد. Kindom: Fungi Phylum: Basidiomycota Class: Basidiomycetes Subclass: Agaricomycetidas Order: Ceratobasidiales Family: Ceratobasidiaceae Genus: Thanatephorus Species: T.cucumeris R. solaniکه در ابتدا از غده های سیب زمینی به دست آمد (Kuhn, 1858)، امروزه عامل بیماری زا در بسیاری از گونه های گیاهی می باشد .(Ritchie, 2006) R. solaniیک بازیدومیست است که به فرم اسکلروت در خاک زندگی می کند (Yong et al., 2008). بر طبق تعریف Ogoshi(1996)، R. solani یک گونه ی جهان گستر و بین المللی است که به 500 گونه گیاهی آسیب می رساند. پانزده گروه آناستوموزی(AG) از آن شناخته شده است و جدایه های آلوده گر گیاه سیب زمینی به زیرگروهAG-3 تعلق دارد (Carling et al., 2003). به طور کلی بیشترین میزبان گروه های آناستوموزیR.solani محصولات مهم و اقتصادی می باشند و به طور مثال جدایهAG-1 به Fabaceae و Graminaceae و جدایهAG2-1Grucifera و AG-3سیب زمینی و دیگر اعضای خانوادهSolanaceae را آلوده می کند (Ogoshi, 1987). AG-4 و AG2-2 به ترتیب باعث پوسیدگی ریشه و طوقه و مرگ گیاهک در چغندرقند می شود. البته AG-4 و AG2-2 در برخی دماها بیمارگر سیب زمینی هستند ولی، به طور کلی تخریب کمی را سبب می شوند (محمودی وهمکاران، 1383).Sneh et al(1986)،AG-4 را عامل آلودگی ساقه های سیب زمینی دانست.Yanar و همکاران در سال 2006 در طی تحقیقاتی در خصوص بیماری شوره سیاه و شانکر خشک در ترکیه، بیان داشت که 88/83% جدایه های آلوده گر گیاه سیب زمینی متعلق به AG-3 می باشند و جدایه های متعلق به سایر گروه های آناستوموزی حدود 59/5-33/0% می باشند که جدایه های AG-1, AG-6, AG-8, AG-9, AG-10, AG-12, AG-13 را شامل می شوند. که البته جدایه های AG-6, AG-8, AG-9, AG-10, AG-12و AG-1 فقط به مناطق خاصی از ترکیه محدود هستند و AG-4 در این بررسی دیده نشد. (1989)Anguize and Martin ،گروه های آناستوموزی AG-1, AG-3, AG-2-1, AG-4, AG-5, AG-9 را به عنوان عامل بیماری شوره سیاه و شانکر ساقه معرفی نمود. Demiric & Doken(1993)، پنج گروه آناستوموزی AG2-1, AG-2-2, AG-3, AG-4, AG-5 را از جدایه های R. solaniاز غده های آلوده گیاه سیب زمینی، در شرق ترکیه گزارش نمودند. در بررسی در آناتولی توسط Tuncer and Erdiler(1990)، فقط جدایه های AG-3 از سیب زمینی های آلوده به دست آمد. Yanar علت مشاهده ی گروه های متفاوتی از جدایه ها روی سیب زمینی های آلوده را مربوط به تناوب محصولات، شرایط آب و هوایی و ارتفاع متفاوت مناطق بررسی شده دانست. به طور کلی جدایه های AG-3, AG-1, AG-2-1, AG-4, AG-5, AG-9 از سیب زمینی های آلوده از مناطق مختلف جهان گزارش شده است (Chang & Tu, 1980Campion et al., 2003;) ولی، جدایه ی AG-3 به عنوان عامل اصلی بیماری ریزوکتونیا سیب زمینی در نظر گرفته می شود (Bandy et al., 1988; Carling and leiner, 1986) در بیماری زایی AG-3 تغییر پذیری زیادی وجود دارد.Warton و همکاران در سال 2009 بیان داشت عامل بیماری شوره سیاه غده ها و شانکر ساقه و استولون سیب زمینی در میشیگان قارچ R. solani AG3 می باشد. ریزوکتونیا بر اساس تعداد هسته های موجود در هر سلول هیف به سه دسته ریزوکتونیاهای تک هسته ای، دو هسته ای و چند هسته ای گروه بندی شده است (Moore, 1996). دو گروه اخیر به نوبه ی خود و بر اساس مفهوم گروه بندی آناستوموزی به چندین گروه که از لحاظ ژنتیکی مجزا هستند، تقسیم بندی می شوند (Carling et al., 2002) در حقیقت استفاده از روش های بیوشیمیایی مولکولی در مطالعه ی تنوع ژنتیکی جدایه های ریزوکتونیا، تایید کننده ی نتایج حاصل برمبنای واکنش آناستوموز است. در ایران هم ریزوکتونیای دو هسته ای و هم ریزوکتونیای چند هسته ای گزارش شده است (سلطانی نژاد، 1386). اولین بار ریزوکتونیای دو هسته ای توسط رحیمیان از ایران گزارش شد و گونه ی آن R. oryzae_sativaeو گروه آناستوموزی آن AG-Bb تعیین شد. وی در سال 1989، عامل لکه چشمی گندم راR. cerealis و گروه آناستوموزی AG-D معرفی نمود.ریزوکتونیای دو هسته ای دیگری نیز از ریشه ی کاج ایرانی و سرو نقره ای (ذاکری وبنی هاشمی،1372) و ریشه ی اسپرس (شریف نبی و بنی هاشمی،1374) گزارش شد، ولی گروه آناستوموزی آن مشخص نگردید. کار تعیین گروه های آناستوموزی ریزوکتونیا در ایران با جداسازی AG4 از سویا ، پنبه و اسپرس (شریف نبی و بنی هاشمی،1374)پسته (اشکان و همکاران،1374) ادامه یافت. هم چنین، ریزوکتونیا چند هسته ای از گیاهان آتری پلکس، پنیرک، تاج خروس، شاه پسند، گل حنا، گل ناز و ریزوکتونیای دو هسته ای از گیاهان اوکالیپتوس ، اویارسلام، بادمجان، پریوش، زیتون، کنار و ناترک استخراج شد. گونه ی دو هسته ایR. solaniجدایه AG-4می باشد. که گروه اخیر به عنوان عامل مرگ گیاهچه نیز گزارش شده است (صفایی و همکاران، 1378). 1-13-3- مشخصات مرفولوژیک R. solani قارچ R. solani شامل یک مجموعه ای از قارچ های میکروسکوپی مختلف با گوناگونی وسیع ژنتیکی می باشد که از ریشه های گیاه و خاک جمع آوری می شود و بیمارگر گیاهان مهم اقتصادی، ساپروفیت مواد آلی و همزیست با ارکید و خزه می باشد (Ganzalez, 2006). رشته های میسلیوم، عقیم با جداره ی عرضی و انشعاباتی با زاویه ی قایمه دارند و در محل انشعاب دارای فشردگی است(شکل 1-2). رشته های میسلیوم وقتی جوان هستند به رنگ سفید ولی با گذشت زمان قهوه ای رنگ می شوند. فرم جنسی فقط در شرایطی که رطوبت زیاد باشند به وجود می آیند. بازیدوسپورها به ابعاد 7تا12×1.5 تا 3.5 میکرون می باشند که روی بازیدیوم هایی که روی توده میسلیوم فوق به وجود می آیند تشکیل می شوند (جعفرپور،1370). R. solaniبر اساس ترکیب ریسه ها به گروه های آناستوموزی تقسیم می شود. گروه های آناستوموزی بیماری زایی و دامنه میزبان متفاوتی دارند شکل1-2: قارچ R. solani (ویکیپدیا، 2011) اعمال یک دوره به خصوص تنش محیطی باعث تحریک قارچ ها (به خصوص بازیدومیست ها) در تولید شکل جنسی می شود. اعمال تنش غذایی روشی موفق برای تولید فرم جنسی در قارچ ریزوکتونیا می باشد. توانایی بالقوه تولید فرم جنسی در تمام ریزوکتونیا وجود دارد. توانایی اسپور دهی R. solani بستگی به ژنوتیپ جدایه ی به کار رفته دارد. کاهش شدت نور در طبیعت باعث پیشرفت مرحله ی جنسی در این قارچ می شود. به همین دلیل تولید بازیدیوسپور در فصل بهار و پاییز با نظم بیشتری انجام می شود (هادی زاده وبنی هاشمی، 1385). رطوبت بالا برای تشکیل تلمورف اهمیت دارد. مطلوب ترین دما برای تشکیل تلمورف گونه های ریزوکتونیا 20-30 درجه ی سانتی گراد است. دمای 18-14 درجه ی سانتی گراد در شب و دمای 26-23 درجه ی سانتی گراد در روز برای تشکیل تلمورف مناسب است. بیشترین اسپوردهی R. solani در شب اتفاق می افتد، در حالی که در روز کاهش می یابد. تلمورف ممکن است روی خاک، بقایای گیاه، آگار یا آب تشکیل شود. تکنیک های بیو شیمیایی شامل سرولوژی، زیموگرام، پکتیک آنزیم، تجزیه ی ایزوزیم و اسید چرب، ترکیب DNA و آنالیز RFLPs برای مطالعه ی فیزیولوژی روابط بین جدایه ها و گروه های آناستوموزی گونه ها مفید می باشد. نتایج حاصله نشان داده است که جدایه های درون گروهی آناستوموزی از نظر ژنتیکی به هم مربوط هستند. 1-14-اهمیت اقتصادی بیماری قارچ R. solani طیف میزبانی وسیعی دارد. این قارچ در مناطق مختلف ایران از روی بسیاری از گیاهان من جمله برنج، سیب زمینی، پنبه، لوبیا، نخود، ماش، عدس، لوبیا چشم بلبلی، چغندر، یونجه، کنف، سوژا، گلرنگ، بادمجان، گوجه فرنگی، کاهو، توتون، تنباکو، باقالا و بسیاری از گیاهان زینتی و علف های هرز گزارش شده است. بیماری هایی که توسط قارچ R. solani ایجاد می شوند شامل مرگ گیاهچه، سوختگی غلاف برنج، پوسیدگی ریشه و ساقه، پوسیدگی اندام های ذخیره ای و در برخی موارد موجب پوسیدگی اندام های گیاه می باشد(سلطانی نژاد و محمودی،1386). شانکر ساقه ریزوکتونیا و شوره سیاه، یک بیماری مهم اقتصادی سیب زمینی در جهان است. این بیماری کیفیت محصولات سیب زمینی را پایین می آورد و مانع بزرگی برای صادرات بذر سیب زمینی است(Bains et al., 2002). R. solani هر ساله موجب کاهش قابل توجهی از محصولات سیب زمینی می شود. ضایعات منسوب به این قارچ در بخش های مختلف جهان حدود 5 الی 34 درصد تخمین زده می شود (Hide et al, (Banvill, 1989; این بیمارگر خاکزی به طور کلی توان گیاه و انرژی تولید غده و محصول را در سیب زمینی کاهش می دهد (Bautlsta et al., 2007). 1-15-چرخه‌ی بیماری بیماری ریزوکتونیا توسط عاملی خاکزی و یا بذرزاد ایجاد می گردد. بیمارگر بعد از زمستان، به صورت میسلیوم و یا اسکلروت روی غده های آلوده و یا بقایای گیاه و یا در خاک آلوده وجود دارد. در هنگام کاشت غده های آلوده در فصل بهار، قارچ ها از سطح غده ی بذری رشد می کنند سپس به ریشه و استولون و برگ و جوانه ی اولیه گسترش می یابد. غده ی بذری آلوده در ایجاد بیماری بسیار موثر است، زیرا در مجاورت محل رشد جوانه و استولون قرار دارد (شکل 1-3). میسلیوم و اسکلروت های موجود در خاک روی مواد آلی زنده می مانند و به طور مستقل و یا همراه با غده ی بذری آلوده، سبب ایجاد بیماری می شوند. ریشه و استولون در هر زمانی از فصل رشد ممکن است توسط قارچ بیمارگر آسیب ببیند، اگرچه بیشترین آلودگی احتمالا در بخش اولیه چرخه ی رشد گیاه اتفاق می افتد. گیاهانی که به آلودگی استولون مقاومت نشان دهند ظهور بیشتری دارند و در نتیجه ضایعات کمتری دارند. تحقیقات نشان داده است که دمای خاک، فاکتور مهمی در شروع بیماری ریزوکتونیا در سیب زمینی است. شدت بیماری با مناسبت ترین دمای رشد بیمارگر همبستگی مثبت دارد. دامنه ی دمای مطلوب، برای رشد R. solani جدایه ی ,AG34 الی 77 درجه ی فارنهایت می باشد. بنابراین هنگامی که، دمای خاک در این دامنه ی دمایی قرار داشته باشد گیاهان مستعد آلودگی خواهند شد. دمای سرد و رطوبت بالا و حاصل خیزی و خنثی بودن خاک (PH=7 و یا کمتر) برای توسعه ی بیماری ریزوکتونیا مطلوب خواهد بود. شدیدترین آسیب در دمای سرد است به دلیل این که سرعت رشد ساقه و استولون نسبت به رشد قارچ پایین است. به هر حال دمای بالای خاک مخصوصا در مراحل اولیه ی رشد گیاه، موجب کاهش اثرات R. solaniمی شود حتی در صورتی که قارچ فراوان باشد. اسکلروت در فصل بعدی، با از بین رفتن بخش عمده ی رشد خود را شروع می کند. مکانیسم درگیر در تشکیل اسکلروت غده های جدید از نحوه ی آلودگی گیاه مادر متفاوت است. مکانیسم محرک تشکیل اسکلروت هنوز شناخته نشده است، ولی احتمالا محصولات گیاهان مسن را درگیر می کند(Whartonet al., 2009). [1]Janick [2]Wartonet al. دریافت فایل بررسی های آناستوموزی و تنوع ژنتیکی جدایه های R. solani عامل بیماری شانکر ساقه و شوره سیاه سیب زمینی

فایل خود هیپنوتیزم عزت نفس

فایل خود هیپنوتیزم عزت نفس فایل خود هیپنوتیزم عزتتتتتت نفس  دریافت فایل فایل خود هیپنوتیزم عزت نفس

طراحی و استقرار روش جدید سم زدایی سریع از واکسن سیاه سرفه

طراحی و استقرار روش جدید سم زدایی سریع از واکسن سیاه سرفه فهرست مطالب عنوان صفحه خلاصه فارسی 1 فصل اول: کلیات 1-1. بیان مسئله 3 1-2. تاریخچه بیماری سیاه سرفه 4 1-3. باکتریولوژی 7 1-4. ترکیبات مهم باکتری سیاه سرفه 10 1-4-1. توکسین پرتوسیس 10 1-4-2. فیلامنتوس هموگلوتینین (FHA) 12 1-4-3. فیمبریه و آگلوتینین ها 13 1-4-4. پرتکتین 15 1-4-5. آدنیلات سیکلاز (ACT) 16 1-4-6. تراکئال سایتو توکسین (TCT) 17 1-4-7. توکسین حساس به حرارت 18 1-4-8. BrKA 18 1-4-9. اندوتوکسین 19 1-5. سویه های بوردتلا پرتوسیس 19 1-6. اپیدمیولوژی 20 1-6-1. وضعیت بیماری در ایران 21 1-7. بیماری زایی سیاه سرفه 21 1-8. علائم کلینیکی 22 1-9. تشخیص بیماری 23 1-9-1. تشخیص بالینی 23 1-9-2. علائم کلینیکی در نوزادان 24 1-9-3. کودکان، نوجوانان و بزرگسالان 25 1-10. پاسخ ایمنی در برابر سیاه سرفه 26 1-10-1. پاسخ ایمنی همورال 27 1-10-2. پاسخ ایمنی سلولی 28 1-11. روش های آزمایشگاهی تشخیص. 30 1-11-1. کشت 30 1-11-2. سرولوژی 30 1-11-3. PCR 32 1-12. مدیریت بیماری 33 1-13. پیشگیری 34 1-13-1. راهبردهای بالقوه در مهار بیماری سیاه سرفه در اوایل نوزادی 35 1-13-1-1. واکسیناسیون بالغین و سالمندان 37 1-13-1-2. حفاظت غیرمستقیم نوزادان از طریق واکسیناسیون والدین 37 1-13-1-3. ایمن سازی نوزادان و کودکان 38 1-13-1-4. واکسیناسیون مادر در دوران بارداری 38 1-14. استراتژی های واکسن 39 1-14-1. واکسن غیر سلولی سیاه سرفه 39 1-14-2. واکسن سلولی سیاه سرفه 40 فصل دوم: مروری بر متون گذشته 2-1. تاریخچه تولید واکسن سیاه سرفه 42 2-1-1. تعریف تست کنترل سمیت زدایی (MWGT) 43 2-1-2. تعریف تست حفاظتی داخل مغزی موش (تست توانمندی Potency test) 44 2-1-3. ابداع روش کشت 44 2-1-4. جداسازی سلول باکتری از کشت 45 2-2. تاریخچه تولید واکسن سیاه سرفه در انستیتو رازی 46 2-3. غیرفعال سازی سوسپانسیون سلولی باکتری سیاه سرفه 47 2-3-1. استفاده از فرمالین و تیومرسال برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه 47 2-3-2. استفاده از گلوتار آلدهید برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه 49 2-3-3. استفاده از حرارت برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه 49 فصل سوم: مواد و روش ها 3-1. تجهیزات و وسایل 51 3-2. مواد و محیط ها 52 3-2-1. محیط کشت آگار بورده ژانگو 52 3-2-2. محیط کشت وِروِی 53 3-2-3. محیط B2 54 3-2-4. محیط کشت سویابین کازئین 54 3-2-5. محیط تیوگلیکولات براث 55 3-3. روش کار 56 3-3-1. انتخاب سویه های بوردتلا پرتوسیس 56 3-3-1-1. لیوفیلیزه کردن 56 3-3-2. کشت باکتری سیاه سرفه 56 3-3-2-1. کشت تجدید حیات روی محیط بورده ژانگو 56 3-3-2-2. کشت بذر روی محیط وِروِی 57 3-3-2-3. مراحل انجام کشت فرمانتوری باکتری سیاه سرفه 57 3-3-2-3-1. استریلیزاسیون فرمانتور 57 3-3-2-3-2. آماده سازی و بهینه سازی محیط کشت فرمانتوری 58 3-3-2-3-3. تلقیح بذر به محیط کشت در فرمانتور 58 3-3-3. جداسازی باکتری سیاه سرفه از محیط کشت 59 3-3-3-1. جداسازی سلول باکتری با استفاده از سانتریفوژ 59 3-3-3-2. جداسازی سلول باکتری با استفاده از سیستم میکرو فیلتراسیون 59 3-3-4. غیرفعال سازی سلول باکتری سیاه سرفه 60 3-3-5. سمیت زدایی سوسپانسیون باکتری سیاه سرفه 60 3-3-5-1. سمیت زدایی با استفاده از فرمالین 61 3-3-5-2. سمیت زدایی با استفاده از تیومرسال 61 3-3-6. تست های کنترلی سوسپانسیون سیاه سرفه 61 3-3-6-1. تست استریلیتی 61 3-3-6-2. تست کنترل غیرفعال بودن باکتری 62 3-3-6-3. تست کنترل سمیت زدایی (MWGT) 62 3-3-6-4. تست توانمندی 62 فصل چهارم: نتایج 4-1. تجدید حیات بذر بر روی محیط بورده ژانگو 64 4-2. تهیه بذر در محیط وِروِی 64 4-3. کشت فرمانتوری باکتری سیاه سرفه برای تولید واکسن 64 4-4. جداسازی باکتری سیاه سرفه از کشت 67 4-5. غیرفعال سازی و سمیت زدایی باکتری سیاه سرفه برای تولید واکسن 69 4-5-1. سمیت زدایی با فرمالین 69 4-5-2. سمیت زدایی با تیومرسال 69 4-6. آزمایش های کنترلی سوسپانسیون های سیاه سرفه 69 4-7. نتایج حاصل از آزمون MWG در کنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سلولی سیاه سرفه سمیت زدایی شده با فرمالین و تیومرسال 72 4-8. آزمون MWG و مقایسه تغییرات اوزان موش ها 75 4-9. تست توانمندی واکسن های آزمایشی سیاه سرفه 80 فصل پنجم: بحث و پیشنهادات بحث 83 نتیجه گیری و پیشنهادات 88 منابع 89 خلاصه انگلیسی 97 ضمایم 98 فهرست جداول عنوان صفحه جدول1-1. آنتی ژن های مختلف سیاه سرفه 9 جدول1-2. علائم کلینیکی بیماری سیاه سرفه 26 جدول1-3. آنتی بیوتیک های مورد استفاده در درمان سیاه سرفه حاد و رژیم مصرف آن 34 جدول1-4. واکسیناسیون سیاه سرفه در کشورهای مختلف 36 جدول2-1. ترکیب محیط لیستر و B2 بر اساس گرم در لیتر 45 جدول3-1. لیست دستگاه ها و تجهیزات مورد استفاده 51 جدول3-2. لیست مواد و محیط های مورد استفاده در تولید واکسن سیاه سرفه 52 جدول3-3. ترکیبات محیط بورده ژانگو 53 جدول3-4. ترکیبات محیط کشت وِروِی 53 جدول3-5. ترکیبات محیط کشت B2 54 جدول3-6. ترکیبات محیط کشت سویابین کازئین 55 جدول4-1. اطلاعات دوره کشت باکتری سیاه سرفه برای تولید واکسن 68 جدول4-2. نتایج حاصل از انجام آزمایش های غیرفعال سازی و استریلیتی سوسپانسیون های باکتری سیاه سرفه سمیت زدایی شده با فرمالین 70 جدول4-3. نتایج حاصل از انجام آزمایش های غیرفعال سازی و استریلیتی سوسپانسیون های باکتری سیاه سرفه سمیت زدایی شده با تیومرسال 71 جدول4-4. نتایج حاصل از کنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سمیت زدایی شده با فرمالین و تیومرسال با استفاده از آزمون MWG 73 جدول4-5. نتایج کنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سمیت زدایی شده با فرمالین با استفاده از آزمون MWG 76 جدول4-6. نتایج کنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سمیت زدایی شده با تیومرسال با استفاده از آزمون MWG 77 جدول4-7. نتایج حاصل از انجام تست توانمندی برای شش واکسن تجربی سمیت زدایی شده با فرمالین (FDV) 80 جدول4-8. نتایج حاصل از انجام تست توانمندی برای شش واکسن تجربی سمیت زدایی شده با تیومرسال (TDV) 81 فهرست نمودارها عنوان صفحه نمودار1-1. مقایسه تعداد افراد زیر یک سال ایمن شده با واکسن DTP در سه کشور مختلف در سال 2000 تا 2010 6 نمودار4-1. تغییرات pH کشت سویه 134 از باکتری سیاه سرفه در طول دوره رشد درفرمانتور 65 نمودار4-2. تغییرات pH کشت سویه 509 از باکتری سیاه سرفه در طول دوره رشد درفرمانتور 65 نمودار4-3. مقایسهی میانگین جذب نوری در طول موج های530 و590 در مقدار جرم باکتری در هنگام برداشت در بچ های مختلف سویه 134 و 509 66 نمودار4-4. مقدار غلظت نهایی باکتری سیاه سرفه (cell109×1) سویه 134 در پایان دوره کشت در هنگام برداشت 66 نمودار4-5. مقدار غلظت نهایی باکتری سیاه سرفه (cell109×1) سویه 509 در پایان دوره کشت در هنگام برداشت 67 نمودار4-6. مقایسه دوره ی سمیت زدایی سوسپانسیون های سلولی سیاه سرفه سویه 134 توسط فرمالین و تیومرسال با استفاده از تست MWG 74 نمودار4-7. مقایسه دوره ی سمیت زدایی سوسپانسیون های سلولی سیاه سرفه در سویه 509 توسط فرمالین و تیومرسال با استفاده از تست MWG 74 نمودار4-8. مقایسه اختلاف وزن موش های تزریق شده با واکسن تجربی سمیت زدایی شده با فرمالین نسبت به تیومرسال در سویه 134 78 نمودار4-9. مقایسه اختلاف وزن موش های تزریق شده با واکسن تجربی سمیت زدایی شده با فرمالین نسبت به تیومرسال در سویه 509 78 نمودار4-10. مقایسه اختلاف وزن موش های تزریق شده با سوسپانسیون های سمیت زدایی شده سویه 134 با تیومرسال و فرمالین نسبت به موش های گروه کنترل 79 نمودار4-11. مقایسه اختلاف وزن موش های تزریق شده توسط واکسن سیاه سرفه حاصل از سمیت زدایی با فرمالین وتیومرسال در سمیت زدایی درسوش509 توسط تست MWG 79 نمودار4-12. مقایسه نتایج حاصل از توانمندی واکسن های تجربی سمیت زدایی شده با فرمالین (FDV) با واکسن های تجربی سمیت زدایی شده با تیومرسال((TDV 81 هرست اشکال عنوان صفحه شکل1-1. کوکوباسیل سیاه سرفه 7 شکل1-2. اتصال بوردتلا پرتوسیس به سلول های پوشش مژه دار مجاری تنفسی 9 شکل1-3. شمای شماتیک از پرتوسیس توکسین 11 شکل3-1. فرمانتور استفاده شده برای کشت سیاه سرفه 58 خلاصه فارسی سیاه سرفه بیماری عفونی باکتریال دستگاه تنفس است که عامل آن بوردتلا پرتوسیس از دسته باکتری های گرم منفی می باشد. در این مطالعه شش بچ از سویه های 134 و 509 باکتری سیاه سرفه تهیه شده و مورد مقایسه قرار گرفتند. از دو روش فیزیکی سانتریفوژ و میکروفیلتراسیون برای جداسازی سلول باکتری از محیط کشت استفاده گردید. سپس سلولهای جداسازی شده باکتری درPBS خنک و استریل در غلظت متوسط Ou/ml 150-100 حل شده و به دو قسمت تحت نامهای سوسپانسیون سمیتزدایی با فرمالین (FD) و سوسپانسیون سمیت زدایی با تیومرسال (TD) تقسیم شدند. به سوسپانسیون هایFD بعد از غیرفعال سازی در حرارت 56 درجه سانتیگراد بمدت 10 دقیقهmM 10فرمالین (7/37 %) اضافه گردید و به سوسپانسیون هایTD در شرایط مشابه، بعد از غیرفعال سازی با حرارت، w/v 01/0 % تیومرسال بصورت محلول اضافه شد. سپس هر دو سوسپانسیون در دمای 8-4 درجه سانتیگراد برای سمیت زدایی انکوبه شدند. در روزهای 10، 30، 90، 180 و 270 از هر دو نوع سوسپانسیون نمونه برداری شد تا سمیت آنها با انجام تست افزایش وزن موش (MWG) مورد ارزیابی قرار گیرد. در نهایت نیز شش واکسن آزمایشی FD وTD از مخلوط کردن غلظت های مشابه دو سویه 134 و 509 تهیه گردید تا بتوان توانمندی این واکسن ها را در تست حفاظتی موش با تستKendrick ارزیابی نمود. نتایج حاکی از آن بود که روش سمیت زدایی با فرمالین با میانگین دوره 6/26 روز در مقایسه با روش سمیت زدایی با تیومرسال با میانگین دوره 195 روز، روش کوتاهتری از نظر زمانی برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه است. توانمندی واکسن تجربی حاصل از سمیت زدایی با فرمالین با میانگین 9/5 از واکسن تجربی حاصل از سمیت زدایی با تیومرسال با میانگین 95/5 قدری کاهش را نشان داده است. براساس نتایج حاصل، فرمالین با کاهش دوره سمیت زدایی در درجه حرارت 8-4 درجه سانتیگراد بمیزان 5/7 برابر بسیار مناسب تر از تیومرسال بود. اگرچه توانمندی واکسن حاصل از روش سمیت زدایی با تیومرسال حدود 05/0 واحد بیشتر از واکسن حاصل از سمیت زدایی با فرمالین است ولی تفاوت از نظر آماری ناچیز بود. کلیدواژهها: بوردتلاپرتوسیس- سمیت زدایی- تیومرسال- فرمالین- تست افزایش وزن موش (MWG) – تست حفاظتی موش با تست kendrik فصل اول کلیات 1-1. بیان مسأله بیماری سیاه سرفه یک عفونت تنفسی بوده که توسط باکتری بوردتلا پرتوسیس از دسته باکتریهای گرم منفی ایجاد می شود. نشانه عمده بیماری سرفه هایی است که ممکن است تا چند هفته نیز طول بکشد که مشخصه آن پاروکسیزمال شدید با سرفه های ناگهانی است که اغلب خاتمه آن با یک دم همراه می باشد. بیماری در نوزادان و اطفال بیشتر رخ می دهد (2و18). در تولید واکسن سلولی سیاه سرفه به روش سنتی و جاری آن در مؤسسه واکسن و سرم سازی رازی جدا سازی باکتری به روش ترسیب با اسیدکلریدریک انجام گرفته و سپس به منظور سمیت زدایی توکسین های موجود در سوسپانسیون سلولی باکتری سیاه سرفه از تیومرسال و انکوباسیون درسردخانه به مدت طولانی 12-9 ماه استفاده می گردد. جدا سازی جرم باکتری با استفاده از اسید از یک سو و فرآیند طولانی سمیت زدایی با مرتیولات از سوی دیگر منجر به کاهش توانمندی واکسن می گردد. لذا در این پروژه با جایگزینی روش های جدا سازی فیزیکی باکتری از محیط کشت بجای روش شیمیایی از یک سو آسیبهای احتمالی به ساختار سلولی باکتری را کاهش داده و از سوی دیگر با استفاده از فرمالین بجای تیومرسال زمان مورد نیاز برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه به حداقل تقلیل یافت تا ضمن کاهش دوره فرآوری آنتی ژن بتوان فرآورده ای با کیفیت مناسب تر را تولید نمود (4). 1-2. تاریخچهی بیماری سیاه سرفه اولین شیوع بیماری سیاه سرفه توسط Guillame De Baillou شناخته شد که اپیدمی آن در تابستان 1578 در پاریس اتفاق افتاد (11). بیشترین اثراین اپیدمی بر روی نوزادان و اطفال بود که باعث ایجاد مرگ و میر بالایی شد. ظاهراً بیماری قبلاً در فرانسه شناخته شده است، زیرا De Baillou به پنجمین اسم مشترک این بیماری اشاره کرده است. او فرض می کرد بیماری باید به صورت صدای سرفه یا 5 ساعت تشنج متناوب منعکس شود. یک بیماری از 16 قرن پیش مانندchyne-cough شناخته شده که شاید پرتوسیس بوده باشد و در سال 1701 در لندن مدت ها سیاه سرفه وchyne-cough به صورت مرگ و میر ظهور می کرده است (12). سیدنهام اصطلاح پرتوسیس را به هر بیماری که با سرفههای شدید همراه بود اطلاق کرد ولی این نام در اواسط قرن هجدهم به بیماری همه گیری محدود شد که ماهیت بالینی مشخص داشت (2). بوردت (Bordet) و ژانگو (Gengou) اولین افرادی بودند که باکتری سیاه سرفه را در سال 1906 در آزمایشگاه کشت دادند و چندی بعد واکسن خام بر علیه این باکتری ساخته شد (22). اولین واکسن سیاه سرفه توسطMedcen در سال 1933 تهیه شد. در این روش سلول های باکتری سیاه سرفه از محیط کشت جدا و سپس با استفاده از گرما غیر فعال شدند (60). قبل از استفاده گسترده از واکسن سلولی سیاه سرفه، در آمریکا 270000 مورد بیماری سیاه سرفه هر سال با بیش از 10000 مرگ و میر گزارش شده است (11). وقوع بیماری سیاه سرفه بعد از واکسیناسیون جمعی کودکان در دهه ی 1940 با واکسن سلولی به طور چشمگیری کاهش پیدا کرد و بیشترین کاهش آن در سال 1976 با تعداد 1010 نفر بیمار گزارش شده است (54). اما از آن به بعد شیوع بیماری دوباره سیر صعودی پیدا کرد که بیشترین افزایش از سال 1959 به بعد بود که بیش از 2500 نفر در سال 2004 به بیماری مبتلا بودند. افزایش این بیماری در آمریکا در بین اطفال و بزرگسالان احتمالاً ناشی از کمشدن ایمنی القا شده توسط واکسن و همچنین افزایش امتناع از واکسیناسیون در این گروه سنی بوده است. از آنجا که غالباً بیماری سیاه سرفه تشخیص داده نمیشود بنابراین تعداد واقعی بیماری از تعداد گزارش شده خیلی بیشتر می باشد. گزارشات سال 2008 هم نشان میدهد که شیوع این بیماری در نوزادانی که سن آنها به سنی نرسیده که سه دوز از واکسن محتوی سیاه سرفه را دریافت نمایند در حال افزایش می باشد (18). در طول سال های 2000 الی 2004 بطور متوسط سالانه 2488 مورد از این بیماری در آمریکا گزارش شده که شامل کودکان کمتر از یک سال است که 63% آنها در بیمارستان بستری شده اند (22). سیاه سرفه در سراسر جهان یک مشکل مهم در کودکان بشمار می آید. سازمان جهانی بهداشت (WHO) اعلام کرده است که سالانه در جهان 45 میلیون مورد از این بیماری دیده می شود که از این تعداد 301408 نفر از کودکان در سال 2002 تلف شده اند (18). علی رغم اینکه بیش از 6 دهه از تاریخ واکسیناسیون مدرن می گذرد، سیاه سرفه هنوز هم یکی از رایج ترین بیماری هایی است که توسط واکسن قابل پیشگیری است. گزارش شده است که بیماری سیاه سرفه در برخی از جمعیت های واکسینه شده در سال های 1980 و 1990 دوباره عود داشته است (8). یکی از عوامل مهمی که واکسیناسیون نتواند ایمنی کامل ایجاد کند آداپته شدن پاتوژن با سیستم ایمنی و کاهش القای سیستم ایمنی توسط واکسن می باشد (48). با وجود پوشش بالای واکسیناسیون، بیش از پانزده سال است که بازگشت عفونت سیاه سرفه در سراسر جهان مشاهده می شود. در حالی که بیماری کلاسیک سیاه سرفه در دوران قبل از واکسیناسیون در درجه اول، یک بیماری دوران کودکی بوده، امروزه با واکسیناسیون گسترده، بروز بیماری بیشتر به نوجوانان و بزرگسالان انتقال یافته است. آمار ارائه شده توسط مراکز کنترل بیماری و پیشگیری (CDC) از سال 2004 نشان می دهد موارد بیماری در افراد سنین 19-10 سال بمیزان 19برابر و در افراد بالاتر از 20 سال به 16 برابر افزایش یافته است (22). در واقع نوجوانان و بزرگسالان نقش قابل توجهی در انتقال سیاه سرفه به نوزادان و کودکانی دارند که نسبت به بروز عوارض بیماری و مرگ و میر ناشی از آن آسیب پذیرتر می باشند. نمودار 1-1 مقایسه تعداد افراد زیر 1سال ایمن شده با واکسنDTP در سه کشور مختلف در سال 2000 تا 2010 از عوامل متعدد در افزایش بروز بیماری سیاه سرفه میتوان از نقصان عملکرد ایمنی پس از عفونت طبیعی و یا حتی خود واکسیناسیون نام برد. لذا بمنظور جلوگیری ار انتقال بیماری از نوجوانان و بزرگسالان به نوزادان و کودکان گسترش استراتژی واکسیناسیون از جمله ایمن سازی جهانی نوجوانان و بزرگسالان بخصوص، کارکنان بهداشت، پرستاران کودکان و والدین نوزادان، میتواند به کنترل بیماری سیاه سرفه کمک شایانی نماید. سیاه سرفه یک تهدید جدی برای نوزادان و کودکان و تا حد زیادی نوجوانان و بزرگسالان است از اینرو، افزایش آگاهی پزشکان با بیماری سیاه سرفه و روش های استاندارد تشخیص آن و عمل به استراتژیهای مختلف واکسیناسیون برای افزایش کنترل این بیماری حائز اهمیت بود (22). درسراسر جهان، سالانه50 میلیون مورد سیاه سرفه اتفاق می افتد که %90 در کشورهای در حال توسعه می باشد. نوزادان، گروه آسیب پذیر با بالاترین میزان عوارض و مرگ و میرهستند، با این حال کودکان، نوجوانان و بزرگسالان در حال حاضر درصد قابل توجهی از موارد را تشکیل می دهند و یک منبع انتقال عفونت به نوزادان هستند. PCR، کشت و سرولوژی روشهای اصلی تشخیص آزمایشگاهی سیاه سرفه بوده که عوامل مختلفی بر حساسیت و ویژگی هر یک از روش های مذکور مؤثر می باشد. با این حال، در سالهای اخیر، PCR به یک روش مناسب با تأثیر قابل توجه در افزایش تشخیص آزمایشگاهی سیاه سرفه تبدیل شده است (22). 1-3. باکتریولوژی عامل ایجاد کننده سیاه سرفه، یک باسیل کوچک گرم منفی و پلی مورف است (شکل1-1). اگرچه ارگانیسم صد سال پیش در ترشحات و نمونه های پاتولوژیک کودکان مبتلا به بیماری سیاه سرفه شناسایی شده بود ولی این ارگانیسم تا سال 1906 که بوردت (Bordet) و ژانگو (Gengou) با استفاده از محیط کشت مخصوص موفق به کشت آن در آزمایشگاه شدند، تکثیر نشده بود. هنوز در بسیاری از آزمایشگاه ها از محیط بوردت-ژانگو برای تکثیر این باکتری استفاده می نمایند. تاکنون محیط های سنتتیک مختلفی برای رشد و تکثیر این باکتری برای تولید واکسن طراحی و بکار گرفته شده است (18). شکل1-1.کوکوباسیل سیاه سرفه دو ارگانیسم دیگر نیز در جنس بوردتلا به نام بوردتلا پاراپرتوسیس و بوردتلا برونشی سپتیکا وجود دارد که پاراپرتوسیس مسئول سندرمی شبیه پرتوسیس در انسان است که معمولاً شدتش از پرتوسیس کمتر است. برونشی سپتیکا بیماریهای تنفسی در حیوانات خانگی را ایجاد می کند. چون ساختارهای DNA این دو ارگانیسم به طور ضروری همانند بوردتلا پرتوسیس است، ممکن است آنها در حقیقت سه ارگانیسم زیر گونه از یک باکتری یکسان باشند (54و10). بین همه ی گونه های بوردتلا، فقط بوردتلا پرتوسیسPT را سنتز می کند. اگرچه کروموزوم بوردتلا پاراپرتوسیس و بوردتلا برونشیسپتیکا دارای لوکوس ژنPT است اما رونویسی آنها بدلیل پروموتور ناقص خاموش می باشد. در فاز حاد، هر سه ارگانیسم فاکتورهای ویرولانس مشابه ایجاد می کنند. بعضی از تحقیقات عدم وجود اطلاعات در مورد این بیماری را تا قبل از قرن 16 میلادی ناشی از سازگاری ارگانیسمهای حیوانی با انسان در 5 قرن گذشته میدانند. اگرچه شواهد اخیر نشان میدهد که ارتباط بوردتلا پرتوسیس با انسان ها ممکن است قدیمیتر از آنچیزی باشد که قبلاً تصور می شد (54). اخیراً سویه هایی از پرتوسیس شناسایی شده اند از جمله بوردتلا هولمسی که در بیماران واجد نقص ایمنی منجر به باکتریمی، اندوکاردیت و بیماری های تنفسی می گردد. سویه دیگر می توان از بوردتلا هینزی نام برد که از خون بیمار مبتلا به ایدز و همچنین از ترشحات دستگاه تنفسی بیمار مبتلا به سیستیک فیبروزیسجدا شده است. اگرچه بسیاری از فعالیت های بیولوژیکی بوردتلا پرتوسیس از مدت ها پیش مشخص شده بود اما تلاش ها برای یافتن ترکیبات مسئول هر یک از فعالیت های متنوع این ارگانیسم برای سال ها ناموفق باقی ماند. بهر حال وقتی ترکیبات و اجزای اختصاصی ارگانیسم مشخص شد نه تنها باعث افزایش درک پاتوژنیسیته بیماری شد بلکه در نهایت منجر به خالص سازی این اجزاء و تولید واکسن غیرسلولی سیاه سرفه شد (18). بوردتلا پرتوسیس تمایل ویژه ای برای اتصال شدید به سلول های پوششی مژه دار در مجاری تنفسی دارد. باکتری ممکن است وارد سلول های پوششی شود اما بطور معمول نمی تواند وارد سلول های غشاء پایه شده و یا به داخل گردش خون تهاجم نماید (شکل1-2). به هر حال توکسین های تولید شده توسط باکتری می تواند به جریان خون وارد شده و عوارض سیستمیک را ایجاد نماید. آنتی ژن های بوردتلا پرتوسیس که در واکسن های غیر سلولی بکار می رود و همچنین سایر آنتی ژن های این باکتری در جدول 1-1 ذکر شده است (18). شکل1-2. اتصال بوردتلا پرتوسیس به سلول های پوششی مژه دار مجاری تنفسی جدول 1-1 . آنتی ژن های مختلف باکتری سیاه سرفه اجزا تشکیل دهنده فعالیتهای بیولوژیکی توکسین پرتوسیس(PT) Pertussis Toxin اگزوتوکسین ترشحی که لنفوسیتوز ، حساسیت به هیستامین ، فعال سازی سلول های جزیره ای پانکراس و تقویت ایمنی را تحریک می کند فیلامنتوس هماگلوتینین Fillamataus Hemaglutinin در اتصال باکتری به سلول مژه ای اپیتلیوم در مجاری تنفسی دخالت دارد فیمبریه Fimbriae در اتصال باکتری به سلول مژه ای اپیتلیوم در مجاری تنفسی دخالت دارد پرتکتین Pertactin پروتئین غشای خارجی که موجب تسهیل اتصال باکتری به سلول مژه ای اپیتلیوم تنفسی می شود BrkA پروتئین غشای خارجی که نقش واسطه برای اتصال به سلول های اپیتلیوم را داشته و در مقابل کمپلمان مقاومت می کند آدنیلات سیکلاز Adenylate Cyclase مانع عملکرد فاگوسیتوز می شود اندوتوکسین Endotoxine موجب تب می شود و واکنش موضعی در حیوان و احتمالاً انسان را منجر می شود تراکئال سایتوتوکسین Tracheal Cytotoxin منجر به استاز و اثرات سایتو پاتیک در موکوس تراکئال می شود درمونکروتیک یا توکسین ناپایدار به گرما Dermonecrotic Or Heat Labile Toxin باعث نکروز پوستی و انقباض عروق در حیوانات می شود 1-4.ترکیبات مهم باکتری سیاه سرفه بوردتلا پرتوسیس دارای دو دسته عوامل ویرولانسی می باشد : دسته اول را ادهسین هایی تشکیل میدهند که شامل فیلامنتوس هموگلوتینین، پرتکتین، فیمبریه و BrkA هستند که در اتصال باکتری به سلولهای مژکدار دستگاه تنفسی فوقانی و ماکروفاژها دخیل هستند. دسته دوم عوامل ویرولانسی باکتری، توکسین هایی هستند که در آسیب موضعی و سیستمیک به میزبان شرکت داشته و شامل پرتوسیس توکسین، آدنیلات سیکلاز توکسین، تراکئال سایتوتوکسین، درمونکروتیک توکسین و اندوتوکسین می باشد (1). 1-4-1. توکسین پرتوسیس قبلاً به توکسین پرتوسیس یا PT فاکتور تحریک کننده لنفوسیتوز‌ (LPF) می گفتند، که مهمترین عامل پاتوژنز سیاه سرفه بود و به طور عمومی باور بر این است نقش مهمی در القاء و ایجاد ایمنی بالینی دارد. PT یک ساختار اولیگومری مرکب از 5 ساب یونیت مختلفS1 تا S5 است. به طور ساختاری PT به کلاس A-B از توکسین باکتریایی تعلق دارد. جزءS1 پروموتوری است که ریبوزیلاسیون ADP از پروتئین های اتصالی تنظیمیGTP را که در انتقال سیگنال در سلول یوکاریوت نقش دارد کاتالیز می کند. پروموتورA یا همان جزءS1 تا حد زیادی مسئول سازماندهی فعالیت های بیولوژیکیPT شامل ارتقاء لنفوسیتوزیس، تحریک سلول های جزیره ای پانکراس، حساسیت به هیستامین، کلاسترینگ سلول های CHO و خاصیت ادجوانی آن می باشد. اولیگومرB ساختار حلقه ای شکل است که محتوی یک کپی از هر یک از ساب یونیت های S2 ، S3 ، S5 و دو کپی ازS4 است. وظیفه مهم اولیگومر B تسهیل اتصال PT به سلول‌های مژه‌دار مخاط مجاری تنفسی است. علاوه بر آن اولیگومر B فعالیت‌های آنزیمی نظیر هموگلوتیناسیونو میتوژنیسیتی سلول‌های لنفوسیت T را نیز دارا می‌باشد. شکل1-3. شمای شماتیک از پرتوسیس توکسین کل مولکول PT برای اکثر فعالیت‌های آنزیمی پروموتور A لازم می‌باشد، از اینرو پروموتور A در غیاب الیگومر B هیچ‌گونه عملکردی نخواهد داشت. سویه‌های مختلف بوردتلاپرتوسیس که از نظر تولید آگلوتینین مختلف می‌باشند همگی یک نوع PT را تولید می‌کنند که PT تولیدی واجد خواص سرولوژیکی و بیولوژیکی یکسانی می‌باشد (56و47). PT توسط بوردتلا پاراپرتوسیس یا برونشی سپتیکا تولید نمی‌شود، اگرچه این ارگانیسم‌ها محتوی ژن‌هایی هستند که می‌تواند فرم فعال PT را در این میکروارگانیسم ها کد کند، اما پروموتورهای این ژن‌ها غیر فعال بوده و لذا توکسین تولید نمی‌شود (30). PT چندین نقش اصلی را در بیماری‌زایی پرتوسیس دارد، اگرچه مکانیسم‌های دقیق عملکرد آن چندان واضح نمی‌باشد. PT اتصال بوردتلا پرتوسیس به سلول‌های مژه‌دار مجاری تنفسی را تسهیل می‌نماید و در توکسیسیتی سلول دخالت دارد. همچنین PT در کلونیزاسیون سلول باکتری در مجاری تنفسی از طریق جلوگیری از مهاجرت نوتروفیل و نقش‌آفرینی آنها در طول اولین هفته بعد از عفونت و جلوگیری از پاکسازی اولیه باکتری توسط آنتی‌بادی نقش دارد. به نظر می‌رسد که PT استراتژی خاصی را برای بروز عفونت حاد و تداوم دوره عفونت حتی در حضور آنتی بادی برای هجوم باکتری فراهم می‌نماید. و جالب‌تر اینکه تزریق داخل وریدی PT در افراد داوطلب بالغ هیچ‌گونه عوارضی را ایجاد نمی‌کند (48). PT یک ایمونوژن قوی است و آنتی‌بادی‌ها برعلیه PT نقش مهمی را در ایمنی بالینی برعلیه سیاه‌سرفه ایفا می‌کنند. در آزمایشگاه تزریق آنتی‌بادی‌های PT به موش‌ها منجر به ایجاد ایمنی در آنها برعلیه تست چلنج داخل مغزی باکتری زنده (تست کندریک) و یا تست چلنج استنشاقی‌می شود (56و57). چلنج موش‌هایی که به طور فعال با تزریق ساب‌یونیت‌های PT ایمن شده و یا به طور غیرفعال با آنتی‌بادی‌های مونوکلونال علیه ساب‌یونیت‌های PT گوناگون ایمن شده اند، نشان می‌دهدکه کل مولکول PT برای ایجاد ایمنی مناسب لازم و ضروری است. توکسوئید PT تولید شده به روش شیمیایی یا ژنتیکی به عنوان جزئی از واکسن غیرسلولی سیاه‌سرفه به‌کار می‌رود (48). 1-4-2. فیلامنتوس هموگلوتینین (FHA) FHA یک مولکول سنجاقی شکل بزرگ است که ابتداء به صورت یک Precursor با وزن مولکولی 367 کیلو دالتونی ساخته شده و سپس با شکست مولکولی در دو طرف به فرم بالغی از پروتئین با وزن 220 کیلو دالتون تبدیل می‌شود. مطالعات آزمایشگاهی بیان می‌کند که FHA یک ادهسین با 4 دومن اتصالی مجزا است که اتصال به مونوسیت‌ها، ماکروفاژها، سلول‌های اپیتلیوم مژه‌دار و حتی سلول‌های غیرمژه‌دار اپیتلیوم تنفسی را تسهیل می‌کند (63). داده ها نشان میدهد کهFHA نقش ایمونومدولاتوری نیز دارد. اثر متقابل FHA با رسپتورهای ماکروفاژها ترشح اینترلوکین12را از طریق مکانیسم اینترلوکین10 سرکوب می‌نماید که این امر منجر به عدم پاسخگویی Th1 و درنهایت پایداری باکتری در بدن می‌گردد (39). ژن ساختمانی هماگلوتینین کلون شده است و از طریق مهندسی ژنتیک قادر هستند که آن راجهت استفاده در واکسن های جدید تولید کنند (2). باکتری‌های موتاسیون یافته فاقد FHA قدرت ناچیزی در باند شدن به سلول‌های پوششی تنفسی دارند. ایمن کردن موش‌ها با FHA آنها را در مقابل چلنج تنفسی با باکتری زنده سیاه‌سرفه محافظت می‌نماید اما در مقابل چلنج داخل مغزی با باکتری زنده سیاه‌سرفه بی‌تأثیر است. با اینحال FHA یک ایمونوژن قوی است و آنتی‌بادی‌های سرمی علیه FHA بعد از عفونت طبیعی و واکسیناسیون با واکسن‌های حاوی این پروتئین ظاهر می‌شود. نتایج یکی از مطالعات اپیدمیولوژی در فنلاند حاکی از این است که آنتی‌بادی‌های FHA در دانش‌آموزان با حفاظتشان در برابر بیماری سیاه سرفه مرتبط است (65). 1-4-3. فیمبریه و آگلوتینین‌ها فیمبریه پروتئینی پلی‌مریک و فیلامنتوس است که توسط باکتری سیاه‌سرفه به صورت خارج سلولی بیان می‌شود. بیش از دوازده آگلوتینوژندر غشاء خارجی سلول باکتری سه گونه ی مختلف از جنس بوردتلا وجود دارد که دو نوع شناخته شده از این آگلوتینوژن‌ها، فیمبریه نامیده می‌شود. بر این اساس دو واژه آگلوتینوژن و فیمبریه مشابه یکدیگر نبوده و نباید بجای یکدیگر به کار روند. الگوی آگلوتینوژن در میان سه گونه بوردتلا با هم فرق می‌کند. حدود هشت آگلوتینوژن در بوردتلاپرتوسیس یافت شده است که از این تعداد 6 آگلوتینوژن در این گونه اختصاصی بوده و از این شش آگلوتینوژن، سه آگلوتینوژن 1، 2 و 3 در بیماری‌زایی و ایمنی علیه بیماری اهمیت دارند (18). آنتی‌بادی‌ها علیه این آگلوتینوژن ها در مطالعات سرواپیدمیولوژی بکار می‌روند. مطالعات In vivo نشان می‌دهد که سویه‌های بوردتلاپرتوسیس توانایی تکثیر در مجاری تنفسی و تراکئای موش را ندارند. سویه‌های بوردتلا برونشی سپتیکا عاری از فیمبریه نیز با اینکه قادر به بیان FHA و دیگر ادهسین‌ها هستند در کلونیزاسیون لوله تنفسی حیوان ناتوان می باشند (14). آنتی‌بادی‌های سرمی علیه فیمبریه معمولاً بعد از بیماری طبیعی یا ایمنی فعال با واکسن محتوی این پروتئین‌ها ایجاد می‌شود. شواهد زیادی دال بر نقش آنتی‌بادی آگلوتینوژن‌ها در ایجاد ایمنی بالینی وجود دارد. دریافت فایل طراحی و استقرار روش جدید سم زدایی سریع از واکسن سیاه سرفه

تحقیق پاورپوینت برآورد نیروی انسانی براساس نگرش سیستمی

تحقیق پاورپوینت برآورد نیروی انسانی براساس نگرش سیستمی لینک دانلود و خرید پایین توضیحات دسته بندی : PowerPoint نوع فایل : .ppt ( قابل ویرایش و آماده پرینت ) تعداد اسلاید : 17 اسلاید برآورد نیروی انسانی براساس نگرش سیستمی از آنجائیکه انسان وجوامع انسانی دربستر زمان قرار دارند ومکلف به حرکت عینی ونیل به کار هستند می توان مقاصد نسبی برای این حرکت درنظر گرفت که فرد درهر زمان دریکی ازاین مسیرها قرار می گیرند طراحی دقیق انتقال از وضعیت موجود به وضعیت مطلوب “مسیر حرکت “ یا “خط مشی “را مشخص می نماید تلاش جهت دستیابی به راههایی که بتوان با توسل به آنها کارکنان سازمان رادروضعیتی قرار داد که وظایف خود رابه نحو احسن انجام دهند بهترین ابزاررا جهت رسیدن به اهداف سازمان دراختیار می گذارد لذا باید تلاش شود که ابتدا سه عامل فرد کار ومدیریت درهر سیستمی روشن گردد . چه کسی چه کاری راتحت چه شرایطی یا چه مدیریتی انجام دهد پرستاری پرستاری یک حرفه پویاست که عملکرد آن بطور مداوم درحال تغییر می باشد اهم فعالیت های پرستاری درحیطه های مختلف درمان: حیطه مراقبتی ودرمانی حیطه حفاظتی حیطه آموزشی حیطه هماهنگی حطیه مراقنت بهداشتی (پیشگیری-درمان وتوانبخشی) سلامتی حق هر انسان است ووضعیتی است که فرد حق مطالبه آن رادارد سازمان مورد بحث ما یعنی بیمارستان جهت دستیابی به اهداف خود : ارائه خدمت و بهبود حال بیماران ودرنهایت اعتلای سطح سلامت جامعه نیاز به همکار کارکنان خاص به نام پرستار یا گروه پرستاری دارد دریافت فایل تحقیق پاورپوینت برآورد نیروی انسانی براساس نگرش سیستمی

تحقیق پاورپوینت بدیع(رشته ادبیات و زبان فارسی)

تحقیق پاورپوینت بدیع(رشته ادبیات و زبان فارسی) لینک دانلود و خرید پایین توضیحات دسته بندی : PowerPoint نوع فایل : .ppt ( قابل ویرایش و آماده پرینت ) تعداد اسلاید : 145 اسلاید بدیع(رشته ادبیات و زبان فارسی) طرح درس کلیات بدیع لفظی: ، روش تجنیس، روش تکرار بدیع معنوی: روش تشبیه، روش تناسب، روش ایهام، شیوۀ فرعی تضمّن، شیوۀ فرعی اغفال، ترتیب کلام، روش تعلیل و توجیه اهداف درس آشنایی با مباحث بنیادی علم بدیع جایگاه درس درس بدیع از دروس پایه دوره کارشناسی زبان و ادبیات فارسی می باشد دریافت فایل تحقیق پاورپوینت بدیع(رشته ادبیات و زبان فارسی)